疏棉狀嗜熱絲孢菌木聚糖酶A在大腸桿菌中的高效表達(dá).pdf

1、木拜糖酶是木聚糖過(guò)程中最關(guān)鍵的—個(gè)酶，水解木聚糖產(chǎn)生木低聚木糖和木糖。疏棉狀嗜熱絲孢茵DSM 5826產(chǎn)生的熱穩(wěn)定木聚糖酶A在較寬的pH范圍內(nèi)活性穩(wěn)定，且降解產(chǎn)物基本均為低聚木糖，具有極大的工業(yè)化應(yīng)用前景。 本文參照大腸桿菌密碼子使用表，對(duì)GenBank中疏棉狀嗜熱絲孢菌DSM 5826木聚糖酶A的基因序列進(jìn)行分析，找出非優(yōu)勢(shì)密碼子，以引物拼接的方式，人工合成出采用優(yōu)勢(shì)密碼子的基因xynA1。將其分別插入到pET-20b和熱激質(zhì)

2、粒pHsh的多克隆位點(diǎn)，得到重組表達(dá)載體pET-20b-xynA、pSsh-xynA1。同時(shí)利用在線軟件分析，優(yōu)化pHsh-xynAl的mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，得到優(yōu)化后的表達(dá)質(zhì)粒pSsh-xynA2。將質(zhì)粒pET-20b-xynA、pnsh-xynal、pHsh-xyna2分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌JMl09([)E3)、JMl09誘導(dǎo)表達(dá)。重組菌(pSsh-xynA2)6 h菌液最高酶活達(dá)到47.1 U/mL，木聚糖酶的表達(dá)量達(dá)到全細(xì)胞蛋白的13.

3、O％，較優(yōu)化前重組菌(pSsh-xynA1)的1．3％提高了10倍。重組菌(pET-20b-xynA)在37℃下 3 h菌液最高酶活達(dá)到4.1 U/mL，16℃下12 h菌液最高酶活達(dá)到50 U/mL。 對(duì)重組菌(pHsh-xyna2)產(chǎn)生的重組木聚糖酶進(jìn)行純化，經(jīng)過(guò)熱處理、DEAE-Sepharose FF離子交換層析、t-Butyl-HIC疏水層析三步共21.5倍的純化最終得到電泳純級(jí)的蛋白，并對(duì)純酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了分析。純