有機(jī)相吸附法固定南極假絲酵母脂肪酶B的研究.pdf

1、本文對(duì)有機(jī)相吸附法固定化南極假絲酵母脂肪酶B(Candida antarctic lipase B，CALB)進(jìn)行了較系統(tǒng)的研究。研究了糖作為添加劑對(duì)固定化酶酯化活性的影響，并且對(duì)糖的影響機(jī)理進(jìn)行了初步探討；利用自制的固定化CALB催化合成乳酸乙酯，采用Plackett-Burman (PB)及響應(yīng)面法(RSM)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，并研究了酶促合成乳酸乙酯的動(dòng)力學(xué)機(jī)制。
　　 首先，從水相吸附、載體涂布和有機(jī)相吸附三

2、種吸附固定形式中，篩選出對(duì)CALB固定化效率較高的是有機(jī)相吸附，并確定了樹(shù)脂NKA-9為固定化載體，異辛烷為固定化介質(zhì)。通過(guò)單因素和正交實(shí)驗(yàn)，考察了吸附時(shí)間、酶載比、溫度、pH和初水量對(duì)固定化酶活性的影響。得到最佳固定化條件為：吸附時(shí)間2.5 h、酶載比1:80(質(zhì)量比)、溫度30℃、pH 6.0以及初水量75 μL。此條件下制備得到的固定化酶的活性最高，酶活回收率達(dá)83.33[％]。
　　 其次，以酶催化乳酸和乙醇的酯化反應(yīng)為

3、模型反應(yīng)，選取糖為添加劑，考察了糖的種類(lèi)及濃度對(duì)固定化酶酯化活性的影響。結(jié)果表明海藻糖、蔗糖和葡萄糖的保護(hù)效果較為明顯。由于海藻糖成本較高，選取蔗糖和葡萄糖進(jìn)一步考察糖濃度的影響。在所測(cè)濃度范圍內(nèi)，蔗糖作為添加劑時(shí)乳酸乙酯產(chǎn)率明顯高于以葡萄糖為添加劑時(shí)的產(chǎn)率，最終確定固定化過(guò)程中添加1.5[％](質(zhì)量/體積)的蔗糖以提高固定化酶活性。選取海藻糖、蔗糖和葡萄糖及其處理過(guò)的脂肪酶CALB為樣本，通過(guò)傅立葉紅外光譜初步分析了糖作為添加劑對(duì)固定

4、化酶的影響機(jī)理。
　　 再次，考察了固定化酶的pH穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性。CALB經(jīng)固定化以后，穩(wěn)定性較游離酶明顯提高，與商品酶Novozym 435相比，也表現(xiàn)出了與其相當(dāng)?shù)姆€(wěn)定性。比較了固定化酶在水相反應(yīng)和非水相反應(yīng)的操作穩(wěn)定性，表明自制的固定化酶更適用于催化非水相反應(yīng)。
　　 最后，用自制固定化酶催化乳酸和乙醇的酯化反應(yīng)。通過(guò)Plackett-Burman和RSM實(shí)驗(yàn)，對(duì)底物摩爾比、底物總量、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫

5、度和搖床轉(zhuǎn)速等五個(gè)因素進(jìn)行了優(yōu)化，得到各個(gè)因素的最佳水平為：底物摩爾比8.3:1(醇酸比)、底物總量0.4 g、反應(yīng)時(shí)間26.87 h、反應(yīng)溫度55℃、搖床轉(zhuǎn)速150 rpm。優(yōu)化條件下，實(shí)驗(yàn)得到乳酸乙酯的最高產(chǎn)率為24.32[％]。并最終建立了自制固定化酶催化乳酸乙酯合成的動(dòng)力學(xué)模型，反應(yīng)遵循雙底物抑制的雙乒乓機(jī)制，且在本反應(yīng)體系中，乳酸的抑制作用要大于乙醇。動(dòng)力學(xué)模型的各個(gè)參數(shù)值為：Vmax=18.20 μmol·mL-1·h-1·