表面共展示南極假絲酵母脂肪酶B與嗜熱絲孢菌脂肪酶全細胞催化劑制備及其制備生物柴油研究.pdf

1、在生物柴油制備方法中微生物脂肪酶催化的生物柴油制備方法是最為綠色環(huán)保的，但游離脂肪酶穩(wěn)定性差、回收困難及其固定化成本高等使得生物柴油生產(chǎn)成本偏高。因此，新型生物催化劑—表面展示脂肪酶的全細胞成為近來關(guān)注熱點。本文對實驗室已成功構(gòu)建的表面共展示有具協(xié)同催化效應(yīng)的南極假絲酵母脂肪酶B(CALB)與疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶(TLL)的畢赤酵母工程菌進行高密度發(fā)酵，獲得較大批量的酵母全細胞催化劑，然后在適宜保護劑作用下冷凍干燥獲得具有較好催化性能

2、且便于儲藏的凍干全細胞，并以制備得的表面共展示有CALB與TLL脂肪酶的凍干全細胞作為催化劑催化制備生物柴油。主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下：
　?。?）研究了全細胞催化劑的批量制備。在測序驗證工程菌構(gòu)建正確后，采用高密度發(fā)酵獲得較大批量的菌體細胞，測定了工程菌生長曲線，發(fā)現(xiàn)28℃，200rpm恒溫培養(yǎng)時其對數(shù)生長期出現(xiàn)在20-40h期間。3L發(fā)酵罐高密度發(fā)酵，誘導(dǎo)106h(即發(fā)酵142h)時，細胞水解活力達最高，1,700U/g干細胞，

3、細胞密度也最大，其OD600=378.35，此時為較優(yōu)發(fā)酵終止時間。
　?。?）優(yōu)化了全細胞催化劑冷凍干燥條件。冷凍干燥并添加適宜保護物質(zhì)制備具有較優(yōu)催化活性及儲藏穩(wěn)定性的全細胞催化劑。用不同pH的磷酸鹽緩沖液及含不同保護物質(zhì)的溶液處理收集到的菌體細胞，冷凍干燥制備全細胞干粉。測定制備的全細胞干粉對大豆油與甲醇的轉(zhuǎn)酯化活力，發(fā)現(xiàn) pH7.5的磷酸鹽緩沖液及海藻糖和PEG20000處理的全細胞催化活力較高，且海藻糖處理后的凍干全細胞

4、儲藏穩(wěn)定性更佳，4℃密封儲存3個月后仍保留近80％的催化活力。對保護物質(zhì)的保護機理做了初步探究。SEM檢測表明海藻糖和PEG20000保護下的凍干細胞有層狀交聯(lián)且層與層之間有疏松孔結(jié)構(gòu)，初步推測這些特殊結(jié)構(gòu)可能與其保護作用相關(guān)。
　?。?）對凍干全細胞催化劑進行了酶學(xué)性質(zhì)研究。發(fā)現(xiàn)凍干全細胞具有較好的溫度耐受性及較廣泛的底物適應(yīng)性。豆油介質(zhì)中65℃處理1h后殘留轉(zhuǎn)酯酶活在60％以上，但更適宜較低溫度下的催化反應(yīng)。以豆油為參照，在所

5、選的其他幾種油料中除烏桕梓油外底物甲酯化率均達到豆油的75％以上。有機溶劑對全細胞催化劑催化活力的影響較顯著。實驗選取的7種有機溶劑對全細胞催化劑毒害較大的是甲醇，經(jīng)其處理3h后，全細胞催化活力僅存16％，而經(jīng)叔丁醇、異辛烷、正庚烷、正己烷等疏水性較強的有機溶劑處理全細胞酶活保留達80％以上。
　?。?）應(yīng)用全細胞催化劑催化合成生物柴油，并優(yōu)化了反應(yīng)條件。通過溶劑工程確定20％叔丁醇添加體系為較優(yōu)反應(yīng)體系；通過單因素及正交實驗確定