TGF-β1和MGF對(duì)家兔骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖分化的影響.pdf

1、目的：探討兔骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分離提取和培養(yǎng)方法，并觀測(cè)TGF-β1、MGF在不同濃度和時(shí)間對(duì)體外培養(yǎng)的兔骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖及分化的影響。
　　方法：⑴選取一周齢健康乳兔，采用改良混合酶消化結(jié)合差速貼壁法，分離提取骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞（SMSCs），原代培養(yǎng)行Desmin免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定；⑵取生長(zhǎng)良好的第三代SMSCs以8x103個(gè)/mL的密度接種于96孔板，設(shè)對(duì)照組、不同濃度梯度的TGF-β1組(0.5、1、2、5、10、20ng/mL

2、)和MGF組(15、30、45、75、100、125ng/mL)，加藥后各組繼續(xù)培養(yǎng)6d，顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，每間隔24h，CCK-8法檢測(cè)各組的OD值，確定相對(duì)最佳作用的TGF-β1和MGF濃度；⑶CCK-8法檢測(cè)相對(duì)最佳作用濃度下TGF-β1組、MGF組和TGF-β1+MGF組及對(duì)照組的OD值，Real time PCR檢測(cè)（對(duì)照組、TGF-β1組和MGF組）第0、2、4、6天Myf5和Myogenin mRNA水平變化。<

3、br>　　結(jié)果：①分離提取的家兔細(xì)胞經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)Desmin染色呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。②第4天增殖效果顯現(xiàn)，10ng/mL組OD值顯著高于對(duì)照組及其他濃度組(P<0.01)；第5天，各濃度實(shí)驗(yàn)組OD值均高于對(duì)照組(P<0.01)，其中10ng/mL組 OD值顯著高于其他各組(P<0.01)，20ng/mL組 OD值顯著高于0.5ng/mL、1ng/mL組、2ng/mL組、5ng/mL組（P<0.05）；第6天，各實(shí)驗(yàn)組OD值均高于對(duì)照組(P<

4、0.01)，其中10ng/mL組OD值顯著高于其他各組(P<0.01)，0.5ng/mL組OD值低于1ng/mL組、2ng/mL組(P<0.01)，1ng/mL組OD值與2ng/mL組無(wú)顯著差異(P>0.05)。確定10ng/mL TGF-β1為相對(duì)最佳效應(yīng)濃度值。③第2天增殖效應(yīng)開(kāi)始顯現(xiàn)，各劑量實(shí)驗(yàn)組OD值均顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，100ng/mL組OD值顯著高于15ng/mL組、30ng/mL組、45ng/mL組(P<0.0

5、5)；第3、4、5天各組的OD值進(jìn)一步增高，但整體上升趨勢(shì)同第2天；第6天，45ng/mL組、75ng/mL組、100ng/mL組、125ng/mL組OD值均顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，而15ng/mL組、30ng/mL組與對(duì)照組比較差異無(wú)顯著性(P>0.05)，且其OD值均顯著低于45ng/mL組、75ng/mL組、100ng/mL組、125ng/mL組(P<0.01)，100ng/mL組的OD值均顯著高于其余各組(P<0.01)

6、。確定100ng/mL的MGF為最佳效應(yīng)濃度值。④第2天，MGF組（100ng/mL）OD值顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，而TGF-β1組（10ng/mL）和TGF-β1+MGF組的OD值與對(duì)照組比較無(wú)顯著差異(P>0.05)；第3天至第6天，TGF-β1組、MGF組的OD值均顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，同時(shí)MGF組的OD值顯著高于TGF-β1組的(P<0.01)，但TGF-β1+MGF組OD值與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異(P>0.0

7、5)。⑤對(duì)照組、TGF-β1組、MGF組Myf5的mRNA表達(dá)量呈先上升后下降的趨勢(shì)， Myogenin呈低量弱表達(dá)后緩慢上升的趨勢(shì)。TGF-β1組第4天Myf5的mRNA表達(dá)量高于第0天(P<0.01)，雖也高于同期的對(duì)照組，但無(wú)顯著性差異(P>0.05)；TGF-β1組Myogenin的mRNA表達(dá)量在6天的細(xì)胞培養(yǎng)期內(nèi)與同期的對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)。MGF組第2天Myf5的mRNA表達(dá)量顯著高于同期的對(duì)照組及TGF

8、-β1組(P<0.05)，第4天的表達(dá)量雖高于同期對(duì)照組及TGF-β1組，但也均無(wú)顯著性差異(P>0.05)；MGF組Myogenin在第4天、6天的mRNA表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組和TGF-β1組(P<0.05)。
　　結(jié)論：⑴采用混合酶消化結(jié)合差速貼壁法成功分離提取家兔骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)肌衛(wèi)星細(xì)胞的體外培養(yǎng)和鑒定。⑵TGF-β1在0.5～20ng/mL范圍內(nèi)對(duì)兔SMSCs有促增殖效應(yīng)，以10ng/mL時(shí)促增殖效果相對(duì)最佳，但對(duì)