骨骼肌衛(wèi)星細胞培養(yǎng)和定向誘導分化為心肌樣細胞的研究.pdf

1、目的：為了深入探索骨骼肌衛(wèi)星細胞多向分化的調控機制，為臨床上重大肌病細胞移植治療提供理想的種子細胞。本實驗體外培養(yǎng)了SD大鼠骨骼肌衛(wèi)星細胞，檢測了體內骨骼肌成熟發(fā)育過程中的相關基因表達，進行了5-氮胞苷誘導肌衛(wèi)星細胞分化為心肌樣細胞的研究。 實驗方法與研究內容： 1.用胰蛋白酶對新生鼠骨骼肌組織進行消化，用新改良的percoll密度梯度離心法純化細胞，在低胎牛血清(2％FBS)條件下培養(yǎng)，觀察肌衛(wèi)星細胞分化為成肌細胞、肌

2、管的過程，并對相應的與肌分化相關的基因表達產物進行了免疫熒光等分析以及細胞形態(tài)和生理功能的鑒定等。 2.分別取胚胎大鼠、新生大鼠、成年大鼠骨骼肌組織，然后，再分別提取了肌細胞的總RNA和總蛋白，用RT-PCR方法分析了Myo-D、M-cadherin、GAPDH等基因在不同年齡階段的表達水平；同時用Westernblot法分析了skeletalmyosin蛋白在不同年齡階段的表達水平。 3.本研究在前期低血清誘導肌衛(wèi)星細

3、胞分化的研究基礎上，進一步探索了5-氮胞苷(5-azacytidine)誘導肌衛(wèi)星細胞分化為心肌樣細胞的過程。肌衛(wèi)星細胞在正常血清(15％FBS)條件下培養(yǎng)一周后，用無血清5-氮胞苷誘導24h，然后洗去5-氮胞苷并繼續(xù)在正常血清條件下培養(yǎng)二周，收集細胞用Westernblot方法分別對心肌特異表達的cardiactroponinT蛋白以及骨骼肌特異表達的skeletalmyosin蛋白進行了鑒定和分析，用成年心肌組織做陽性對照。結果：

4、 1.用新改良的percoll密度梯度離心法分離的骨骼肌衛(wèi)星細胞的純度明顯高于用常規(guī)的差速帖壁法所得細胞的純度。肌衛(wèi)星細胞在15％FBS培養(yǎng)條件下可分裂增殖，細胞形態(tài)為梭形。換用2％FBS誘導分化的培養(yǎng)條件下，可見骨骼肌衛(wèi)星細胞逐漸分化為成肌細胞，6天融合成肌管。與此同時，肌衛(wèi)星細胞分化為肌管的過程中出現(xiàn)了自發(fā)收縮現(xiàn)象。免疫熒光分析發(fā)現(xiàn)：肌管的desmin、skeletalmyosin抗體鑒定為陽性；進一步用α-銀環(huán)蛇毒素鑒定不同

5、時期肌細胞表面的乙酰膽堿受體(nicotineacetylcholinereceptor，NAChR)的表達，只見肌管乙酰膽堿受體呈塊狀聚集，而肌衛(wèi)星細胞呈陰性反應；用乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)分別刺激肌衛(wèi)星細胞、肌管，可見乙酰膽堿明顯引起肌管的收縮，而不引起肌衛(wèi)星細胞的收縮。 2.骨骼肌在成熟發(fā)育過程中，Myo-D基因表達水平隨年齡增加逐漸增強，呈現(xiàn)出從胚胎期的微弱表達，到新生期較強表達，最后到成年期高水平

6、表達的模式(弱—強—最強)。M-cadherin基因表達模式為：在胚胎期表達微弱，新生期表達增強，而到成年期完全無表達(弱—強—無)。skeletalmyosin蛋白表達模式為：在胚胎期表達微弱，新生期和成年期強表達(弱—強—強)。 3.用5-氮胞苷(10μmol/L)誘導肌衛(wèi)星細胞，可使誘導后的細胞表達cardiactroponinT，不表達skeletalmyosin；作為陽性對照的成年心肌組織也只表達cardiactrop

7、oninT，不表達skeletalmyosin。相反，未經5-氮胞苷誘導分化的骨骼肌衛(wèi)星細胞只表達骨骼肌特異的skeletalmyosin，不表達心肌特異表達的cardiactroponinT。此外，5-氮胞苷誘導分化后的大鼠骨骼肌衛(wèi)星細胞自發(fā)收縮頻率比只是低血清誘導的細胞自發(fā)收縮頻率增加。 小結： 1.采用新改良的percoll密度梯度離心法早期培養(yǎng)的肌衛(wèi)星細胞純度明顯高于差速貼壁法，較好地滿足了下游實驗需要。

8、 2.SD新生鼠骨骼肌衛(wèi)星細胞體外低血清誘導時可自然向骨骼肌方向分化(成肌細胞，肌管)，并表達相應的骨骼肌細胞特異的蛋白。 3.肌管可表達乙酰膽堿受體，乙酰膽堿受體在肌管的膜上呈塊狀聚集，用乙酰膽堿作用于肌管，可使肌管明顯收縮。而骨骼肌衛(wèi)星細胞乙酰膽堿受體呈陰性表達，對乙酰膽堿作用無收縮反應。 4.在體外，5-氮胞苷(10μmol/L)可誘導(24h)大鼠骨骼肌衛(wèi)星細胞定向向心肌樣細胞分化，誘導后的細胞可表達心肌細胞特異

9、表達的cardiactroponinT蛋白。未經5-氮胞苷誘導的細胞只表達骨骼肌特異的skeletalmyosin。 5.無論大鼠骨骼肌衛(wèi)星細胞自然分化形成的肌管，還是骨骼肌衛(wèi)星細胞經5-氮胞苷定向誘導分化形成的肌管均存在自發(fā)收縮現(xiàn)象，但后者的收縮頻率增加。 結論： 體外培養(yǎng)的骨骼肌衛(wèi)星細胞具有多向分化潛能。在自然分化條件下向成熟骨骼肌方向分化，而5-氮胞苷則可定向誘導骨骼肌衛(wèi)星細胞向心肌樣細胞方向分化，因此，骨