大鼠骨骼肌衛(wèi)星細胞的培養(yǎng)及其誘導分化的實驗研究.pdf

1、為了深入探討骨骼肌衛(wèi)星細胞多向分化的調控機制，為肥胖病、2型糖尿病、異位骨化等疾病提供細胞模型，本實驗體外培養(yǎng)了SD大鼠骨骼肌衛(wèi)星細胞，觀察了其生物學特性，進行了利用成脂誘導劑和成骨誘導劑來對肌衛(wèi)星細胞多向分化潛能的研究。 方法： 1．用混合酶對新生鼠骨骼肌組織進行消化，用反復差速貼壁法(preplate technique)純化細胞。在低胎牛血清(2﹪FBS)條件下培養(yǎng)，觀察肌衛(wèi)星細胞分化為成肌細胞和肌管的過程，并對相

2、應的與肌分化相關的蛋白進行了免疫熒光、Western Blot等分析以及細胞形態(tài)和生理功能的鑒定。 2．用成脂誘導液(10μg/ml胰島素)誘導骨骼肌衛(wèi)星細胞向脂肪細胞分化，通過油紅染色檢測其分化狀況，并利用RT-PCR技術檢測成脂關鍵基因過氧化氫酶體激活增殖受體γ(preoxisome proliferator-activated receptorγ，PPARγ)的表達。 3．用成骨誘導液(10<'-7>mol/l地塞

3、米松、lμmol/lβ-甘油磷酸鈉和50μg/l維生素C)誘導骨骼肌衛(wèi)星細胞向成骨細胞分化，通過細胞堿性磷酸酶活性和鈣化結節(jié)檢測分化狀況。 結果： (1)利用混合酶消化法分離，反復貼壁法純化得到數量較多、純度較高的肌衛(wèi)星細胞。肌衛(wèi)星細胞在20﹪FBS培養(yǎng)條件下可分裂增殖，細胞形態(tài)為梭形。換用2﹪FBS誘導分化的培養(yǎng)條件下，可見骨骼肌衛(wèi)星細胞逐漸分化為成肌細胞，4天融合成肌管。與此同時，肌衛(wèi)星細胞分化為肌管的過程中出現了自

4、發(fā)性收縮現象。免疫熒光和Western blot分析發(fā)現：肌衛(wèi)星細胞desmin、cardiac troponin T抗體鑒定陽性，skeletal myosin抗體鑒定為陰性；肌管cardiac troponin T、skeletal myosin抗體鑒定為陽性；進一步用a-銀環(huán)蛇毒素(a-bungarotoxin，a-BTX)鑒定肌細胞表面的乙酰膽堿受體(nicotine acetylcholine receptor，NAchR)的

5、表達，可見肌管乙酰膽堿受體呈塊狀聚集，而預先用乙酰膽堿(acetylcholine，Ach)孵育后的肌管未見團塊狀聚集；用Ach刺激肌管，可見乙酰膽堿明顯引起肌管的收縮，而預先用a-BTX孵育后的肌管用乙酰膽堿刺激后未見收縮。 (2)肌衛(wèi)星細胞在胰島素的刺激下向著脂肪細胞分化，利用RT-PCR技術檢測發(fā)現成脂過程中的關鍵基因PPARγ在未誘導組有微弱表達，在胰島素誘導組明顯增強，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。 (3

6、)肌衛(wèi)星細胞成骨誘導后，堿性磷酸酶染色陽性，并形成若干礦化結節(jié)。 小結： (1)與傳統(tǒng)的兩步消化法相比，利用混合酶消化法分離、反復差速貼壁法純化可得到數量較多、純度較高的肌衛(wèi)星細胞。 (2)胰島素可能通過增強PPARγ基因的作用來誘導肌衛(wèi)星細胞向脂肪細胞的分化。 (3)聯合應用地塞米松、β-甘油磷酸鈉和維生素C可誘導肌衛(wèi)星細胞向成骨細胞分化。 結論：利用本實驗方法分離得到的SD大鼠骨骼肌衛(wèi)星細胞具