植物乳桿菌JPP2膽鹽水解酶相關(guān)基因克隆與表達的研究.pdf

1、膽鹽水解酶(Bilesalthydrolase，BSH，EC3.5.1.24)是微生物生長、繁殖過程中產(chǎn)生的一種代謝物。膽鹽水解酶是乳酸菌降膽固醇作用過程中的關(guān)鍵酶，該酶能水解結(jié)合態(tài)?；悄懰猁}和甘氨膽酸鹽，將其轉(zhuǎn)變成氨基酸和游離膽酸。目前，很多BSH已經(jīng)從各種微生物中得以純化和鑒定，如乳桿菌、雙歧桿菌、腸球菌、梭狀芽孢桿菌、類桿菌和鏈球菌等。國內(nèi)外大量臨床試驗證實，服用益生菌及其相關(guān)制品具有減少人體血清膽固醇含量，而降血清膽固醇與乳酸菌

2、產(chǎn)生的BSH活力密切相關(guān)。
　　 本文對來源于植物乳桿菌JPP2染色體上的一段編碼膽鹽水解酶基因bsh3進行克隆測序分析，發(fā)現(xiàn)具有五個保守的膽鹽水解酶氨基酸活性位點，分別為Cysteine(C)-2，Arginine(R)-18，Asparticacid(D)-21，Asparagine(N)-175，Arginine(R)-228。與NCBI上同為植物乳桿菌屬的五株菌進行比較，發(fā)現(xiàn)氨基酸序列同源性均達99％以上。
　　

3、 利用中間克隆載體pMD19-T將其構(gòu)建于表達載體pET-28b上，并轉(zhuǎn)化入表達宿主菌E.coliBL21(DE3)，成功構(gòu)建重組BSH的工程菌。由于pET-28b載體攜帶T7強啟動子，在IPTG誘導(dǎo)下，高效表達外源目的基因易導(dǎo)致包涵體的產(chǎn)生，收集菌體經(jīng)高壓均質(zhì)儀破胞，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測和相差顯微鏡觀察，斷定破胞不溶性物質(zhì)中含包涵體。通過鎳離子螯合柱成功分離純化出重組的bsh3膽鹽水解酶，純化后的重組BSH條帶單一，達到電泳純。誘

4、導(dǎo)重組表達載體并提取胞外粗酶液。運用高效液相色譜法檢測其酶活力。對甘氨膽酸鹽、?；敲撗跄懰猁}、甘氨鵝脫氧膽酸鹽三種結(jié)合膽鹽進行酶促反應(yīng)，酶活力分別為：30.75U/mL，32.52U/mL，28.91U/mL。
　　 隨著人們生活水平的逐步提高，動脈硬化、冠心病、心腦血管疾病、高血壓疾病發(fā)病率逐年上升，嚴重影響人們的健康，而血清膽固醇水平過高則是引起上述系列疾病的主要因素之一。本研究的開展，對明確膽鹽水解酶酶學(xué)性質(zhì)，開發(fā)降膽固醇