谷氨酸棒桿菌麥芽寡糖基海藻糖水解酶基因的克隆和表達(dá).pdf

1、海藻糖分子是由兩個(gè)吡喃葡萄糖環(huán)以α,α-1,1-糖苷鍵連接而成的一種十分穩(wěn)定的非還原二糖,它廣泛存在于自然界的很多生物體內(nèi)。海藻糖作為一種天然的非特異性生物保護(hù)物質(zhì),能夠保護(hù)生物細(xì)胞和生物活性物質(zhì)抵抗脫水、冷凍、高溫、高滲、干旱、氧化、輻射乃至有毒化合物等不良環(huán)境。海藻糖已經(jīng)被應(yīng)用到醫(yī)藥、化妝品、食品等多個(gè)領(lǐng)域,有很好的市場(chǎng)前景。
　　 目前,海藻糖的生產(chǎn)方法以生物酶法制備為主。其中,利用TreS途徑由麥芽糖生產(chǎn)海藻糖和利用Tr

2、eY-TreZ途徑由淀粉生產(chǎn)海藻糖最為經(jīng)濟(jì)可行。本文針對(duì)谷氨酸棒桿菌TreY-TreZ途徑的TreZ蛋白,即麥芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)的基因克隆和異源表達(dá)進(jìn)行研究。
　　 首先經(jīng)PCR克隆到谷氨酸棒桿菌ATCC13032 MTHase的編碼基因treZ,長(zhǎng)度為1764bp,將其插入大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pRSET-B,在宿主菌E.coli BL21(DE3)pLysS中誘導(dǎo)表達(dá),結(jié)果得到特異表達(dá)的目的蛋白。優(yōu)化誘導(dǎo)條件后,

3、溶解表達(dá)的目的蛋白約占胞內(nèi)可溶總蛋白的40％,每毫升發(fā)酵液可以表達(dá)可溶目的蛋白0.27mg,仍有部分目的蛋白聚集形成包涵體。經(jīng)薄層層析和離子色譜檢測(cè)證實(shí),該目的蛋白與谷氨酸棒桿菌麥芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)共同作用于糊精后,可以產(chǎn)生海藻糖,具有MTHase的相應(yīng)活性。
　　 繼續(xù)構(gòu)建畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K—treZ和枯草芽孢桿菌表達(dá)載體pHT43-treZ,分別轉(zhuǎn)化畢赤酵母(Pichia pastoris GS1