重組李氏溶血素的純化及阻斷ELISA檢測病原的初步探索.pdf

1、單核增生性李斯特氏菌(ListeriaMonocytogenes，LMO)是人和動物一種重要的食源性細(xì)菌，該菌屬于革蘭氏陽性小桿菌，在免疫缺陷的病人、新生兒、孕婦及動物可導(dǎo)致十分嚴(yán)重的病，稱之為李氏桿菌病。該病以腦脊髓炎、腦膜炎、敗血病、流產(chǎn)為主要特征。LMO對環(huán)境抵抗里很強(qiáng)，可以在酸性、高鹽及低溫環(huán)境下生存，在生的或加工過的食品中也可以發(fā)現(xiàn)LMO。LMO還可以在厭氧的環(huán)境中生長，在真空包裝的食品中仍然可以發(fā)現(xiàn)LMO。當(dāng)食用了LMO污染

2、的食物后，LMO很快穿透腸道屏障到達(dá)肝臟和脾臟，之后散布到腦和胎盤。LMO可以寄生在吞噬細(xì)胞中，并可以在吞噬泡膜上打孔而進(jìn)入宿主胞漿中復(fù)制。近幾年LMO在各地引起的食物中毒，引起了科學(xué)家和政府官員的注意。本文在概述中介紹了LMO的背景、生物學(xué)特性、LMO的毒力因子、感染的分子生物學(xué)進(jìn)展，并且比較分析了近幾年LMO的檢測技術(shù)研究進(jìn)展?！　±钍先苎?ListeriolysinO，LLO)是LMO逃離宿主吞噬泡的主要毒力因子。LLO可以從

3、單核增生性李斯特桿菌的培養(yǎng)基中獲得，但這種方法需要大量的培養(yǎng)基。直到現(xiàn)在，依靠LMO分泌的天然LLO不能滿足研究LMO分子生物學(xué)機(jī)制和對LMO的檢測及對李氏桿菌病診斷的需要。本文利用含陽性質(zhì)粒pGEX-6P-hly的重組大腸桿菌BL-21，利用IPTG作為誘導(dǎo)劑，探索了重組LLO的優(yōu)化表達(dá)條件，包括IPTG的誘導(dǎo)濃度、誘導(dǎo)時間、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時機(jī)及培養(yǎng)基的選擇等。得出在搖床培養(yǎng)的條件下，IPTG濃度為0.6mmol/L、誘導(dǎo)溫度為37℃

4、、誘導(dǎo)時間為150min、誘導(dǎo)時機(jī)為當(dāng)細(xì)菌OD600等于0.25時開始誘導(dǎo)，此時重組LLO的表達(dá)量最大?！　”緦?shí)驗(yàn)表達(dá)的蛋白是以包涵體的形式存在于大腸桿菌的胞漿中，所以，要想純化蛋白，首先要純化包涵體。本文對提包涵體的方法進(jìn)行優(yōu)化，獲得了相對純度比較高的包涵體。利用親和層析純化蛋白，獲得了純化的重組李氏溶血素蛋白。Western-blot分析證明，重組李氏溶血素融合蛋白具有免疫活性。融合蛋白可溶性分析證明，蛋白以幾乎不溶于水的包涵體形