瑟氏泰勒蟲p33基因PCR-ELISA檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用.pdf

1、瑟氏泰勒蟲病是瑟氏泰勒蟲（Theileria sergenti）寄生于牛的紅細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞內(nèi)的血液原蟲病，以長(zhǎng)角血蜱為傳播媒介。牛感染此蟲體后在臨床上表現(xiàn)出高稽留熱、貧血、消瘦、出血以及體表淋巴結(jié)腫大等癥狀。該病可影響母牛產(chǎn)后的出奶量及降低出生小牛的存活率，主要分布在東北亞地區(qū)，危害十分嚴(yán)重，給養(yǎng)牛業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。近幾年，隨著全球經(jīng)濟(jì)迅速發(fā)展，養(yǎng)牛業(yè)逐漸擴(kuò)大，瑟氏泰勒蟲病的流行區(qū)也隨之?dāng)U大，給各地區(qū)以及全國(guó)的畜牧業(yè)帶來不

2、可挽回的經(jīng)濟(jì)損失，引起獸醫(yī)界的廣泛關(guān)注。因此，監(jiān)控、防治和檢測(cè)瑟氏泰勒蟲病，降低其發(fā)病率是當(dāng)務(wù)之急。為此，本試驗(yàn)建立了一種簡(jiǎn)便、特異、敏感的瑟氏泰勒蟲PCR-ELISA檢測(cè)方法，為瑟氏泰勒蟲病流行病學(xué)調(diào)查及診斷提供手段。
　　首先根據(jù)Genbank上發(fā)布的瑟氏泰勒蟲基因序列[DQ078264.1]設(shè)計(jì)兩對(duì)相同序列引物，并在其中一對(duì)引物上下游5'端分別標(biāo)記上生物素(Biot)及地高辛(Dig)，合成一對(duì)標(biāo)有非放射性物引物。從PCR檢

3、測(cè)為瑟氏泰勒蟲病陽性抗凝血中提取基因組DNA，進(jìn)行常規(guī)PCR，獲得該病的目的基因片段，純化回收后，將其克隆到pMD-19T simple載體，進(jìn)行質(zhì)粒PCR及雙酶切鑒定，確定陽性結(jié)果后送往生物公司進(jìn)行測(cè)序，完成基因檢測(cè)。根據(jù)PCR-ELISA方法基本步驟，對(duì)鏈酶親和素濃度、封閉時(shí)間、PCR產(chǎn)物稀釋度、HRP-抗地高辛抗體的稀釋度及顯色時(shí)間等進(jìn)行優(yōu)化，確定反應(yīng)的最佳條件。選取40份經(jīng)PCR檢測(cè)確定為瑟氏泰勒蟲陰性樣本進(jìn)行PCR-ELISA

4、檢測(cè)，測(cè)定OD450nm值，按照公式x+3SD計(jì)算瑟氏泰勒蟲病PCR-ELISA方法的臨界值，確定判定標(biāo)準(zhǔn)。將瑟氏泰勒蟲基因組DNA進(jìn)行倍比稀釋，PCR-ELISA方法測(cè)定，確定敏感性。以牛弓形蟲、新孢子蟲、環(huán)形泰勒蟲等基因組DNA為模板在最佳反應(yīng)條件下檢測(cè)該方法的特異性。通過對(duì)同一時(shí)間包被酶標(biāo)板的重復(fù)性試驗(yàn)和不同時(shí)間包被酶標(biāo)板的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)來檢測(cè)此種方法的穩(wěn)定性。取112份待檢牛抗凝血進(jìn)行檢測(cè)，與常規(guī)PCR法進(jìn)行比較，確定該方法在臨床上

5、的應(yīng)用。
　　結(jié)果表明，常規(guī)PCR檢測(cè)后條帶大小約為421 bp，與Genbank上發(fā)布的瑟氏泰勒蟲基因序列[DQ078264.1]的同源性達(dá)到99％，證明擴(kuò)增的目的片段為瑟氏泰勒蟲。對(duì)各個(gè)試驗(yàn)環(huán)節(jié)進(jìn)行優(yōu)化，得出鏈酶親和素濃度為5μg/mL，HRP標(biāo)記抗地高辛抗體稀釋2000倍，封閉時(shí)間為60 min，PCR產(chǎn)物稀釋30倍，底物顯色15 min時(shí)，為最適的反應(yīng)條件。檢測(cè)40份經(jīng)PCR檢測(cè)確定為瑟氏泰勒蟲陰性樣本得出臨界值為0.17

6、4，樣本OD450nm值大于0.174的為瑟氏泰勒蟲陽性，反之為陰性。PCR-ELISA方法測(cè)出瑟氏泰勒蟲DNA最低濃度為18fg/μL，較常規(guī)PCR法檢測(cè)出的18fg/μL，敏感性高10倍，且與牛弓形蟲、新孢子蟲、環(huán)形泰勒蟲等之間無交叉反應(yīng)，具有較強(qiáng)的特異性。對(duì)112份待檢?？鼓M(jìn)行檢測(cè)，陽性檢出率為34.8％，高于常規(guī)PCR法的28.6％。
　　本試驗(yàn)建立一種特異、敏感、安全、省時(shí)的瑟氏泰勒蟲快速檢測(cè)方法，可適用于瑟氏泰勒蟲