埃博霉素生產(chǎn)菌株選育及埃博霉素抑瘤活性研究.pdf

1、粘細菌是一種革蘭氏陰性細菌，它具有復雜的多細胞行為，纖維堆囊菌是粘細菌中能夠降解纖維素的類群之一。纖維堆囊菌能夠產(chǎn)生多種抗真菌、抗細菌和抗腫瘤作用的生物活性物質(zhì)，其中，通過穩(wěn)定微管來抑制腫瘤細胞生長的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素埃博霉素尤為引人注目。到目前為止，埃博霉素類藥物已成功上市，在抗擊腫瘤細胞中起到十分重要的作用。然而，埃博霉素的生產(chǎn)主要依賴于化學合成法，相比之下，微生物生產(chǎn)法卻并未廣泛應用，主要限制是由于其產(chǎn)生菌纖維堆囊菌發(fā)酵產(chǎn)量水平較低

2、，選育高產(chǎn)纖維堆囊菌來提高埃博霉素產(chǎn)量具有工業(yè)指導意義。
　　 本文對纖維堆囊菌So 0157-2進行了高效的菌株選育，篩選到了埃博霉素A、B產(chǎn)量均有大幅度提高的突變株LG3111776，其高產(chǎn)菌株埃博霉素A、B產(chǎn)量分別為出發(fā)菌株的5倍和3倍左右。接下來，我們又對埃博霉素抗腫瘤機理進行了深入的分析，闡述了埃博霉素A、B混合制劑之間的協(xié)同作用以及埃博霉素對凋亡、自噬的作用現(xiàn)象進行了說明。
　　 在菌株選育中，文中以纖維堆囊

3、菌So 0157-2作為出發(fā)菌株，引進pH極端環(huán)境脅迫選育法對出發(fā)菌株進行馴化，富集優(yōu)勢菌株，并對四株耐受菌株通過高效液相色譜法檢測其發(fā)酵液中埃博霉素A、B，以埃博霉素標準曲線進行擬合分析其產(chǎn)量變化，篩選產(chǎn)量提高的優(yōu)勢菌株LG31。LG31再次作為出發(fā)菌株，利用傳統(tǒng)的紫外誘變和硫酸二乙酯誘變，結合96孔板高通量篩選法初篩、高效液相色譜法驗證，進一步篩選出了突變株LG31-11-7。隨后，菌株LG31-11-7采用紫外誘變與推理選育相結合

4、的方法，分別以耐受高濃度前體乙酸鈉和耐受高濃度終產(chǎn)物兩個角度進行了高效的選育工作，并配合生物指示法和TLC薄層層析法快速篩選正突變株，得到了最終的高產(chǎn)菌株LG3111776。對高產(chǎn)菌株LG3111776進行了發(fā)酵條件優(yōu)化，使埃博霉素產(chǎn)量穩(wěn)定提高，最終穩(wěn)定在43.1 mg/L和22.9 mg/L左右，較初始菌株產(chǎn)量提高了5倍多和3倍多。不但為原生質(zhì)體融合提供了菌株多樣性的親本，并且為工業(yè)生產(chǎn)提高了良好的菌株資源。
　　 當埃博霉素

5、作用于多株腫瘤細胞系時，埃博霉素表現(xiàn)出了良好的抗腫瘤活性。其中，PC3、HELA、KB、K562、MCF-7、U87對埃博霉素最為敏感，并且埃博霉素A、B混合制劑作用后，發(fā)現(xiàn)了獨特的協(xié)同效應。通過細胞周期、細胞凋亡以及Xcelligence監(jiān)控細胞生長三種方法進一步驗證了這種協(xié)同效應。我們推斷這種協(xié)同效應出現(xiàn)的可能原因是埃博霉素A、B之間的競爭作用以及埃博霉素與腫瘤細胞表面蛋白之間離子電荷吸引作用力達到不同程度的飽和而引起的。另外，當埃

6、博霉素A、B作用于U87/LC3腫瘤細胞時，熒光顯微鏡的觀察顯示埃博霉素能夠引起LC3蛋白（微管相關蛋白）點聚狀典型性變化，說明埃博霉素可以誘導U87細胞發(fā)生自噬現(xiàn)象，而自噬現(xiàn)象是細胞程序性死亡的途徑之一。通過對U87細胞LC3蛋白進行GFP熒光轉染標記，我們可以清晰的觀察到由于自噬現(xiàn)象而引起細胞質(zhì)中的點狀結構。DAPI染色細胞核的變化過程則從另一方面說明了埃博霉素在誘導U87細胞凋亡和自噬的之間具有一定依賴作用，這將有助于對埃博霉素藥