埃博霉素生物合成的胞外誘導(dǎo)機(jī)制分析.pdf

1、首先通過液體透析共培養(yǎng)成功建立了在液體培養(yǎng)基中研究微生物種間相互作用的方法。通過這種共培養(yǎng)方法對36種種間微生物進(jìn)行了篩選，篩選出了一株能夠使纖維堆囊菌合成埃博霉素產(chǎn)量提高6％-9%的輔助微生物——LDF＃-放線菌02，通過對該微生物的分子生物學(xué)菌種鑒定確定其為細(xì)黃放線菌5406。使用DMSO、甲醇和乙酸乙酯制備了該放線菌的粗提物，并通過添加實(shí)驗(yàn)探索了三種粗提物分別對埃博霉素合成的促進(jìn)作用，結(jié)果表明甲醇粗提物的促進(jìn)作用最明顯，能夠提高產(chǎn)

2、量20%左右。又進(jìn)一步對甲醇粗提物的添加量進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在一定范圍內(nèi)（體積比0.02%-0.3%）不同甲醇添加量對埃博霉素合成的促進(jìn)作用差別不大，均能達(dá)到20%左右。后又通過對添加甲醇粗提物和單純加入甲醇對埃博霉素合成的促進(jìn)作用進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)甲醇與甲醇粗提物的促進(jìn)作用幾乎無差別，證明是甲醇作為小分子誘導(dǎo)物在促進(jìn)埃博霉素合成中發(fā)揮了重要作用。
　　通過對其它小分子物質(zhì)對埃博霉素合成的影響篩選發(fā)現(xiàn)，甲醇對纖維堆囊菌產(chǎn)埃博霉素的促進(jìn)作

3、用是具有相對專一性的，用于實(shí)驗(yàn)篩選的其它小分子物質(zhì)沒有這種促進(jìn)作用。而且由于甲醇的添加量只有0.05%左右，可以排除甲醇可能作為纖維堆囊菌生長代謝過程中的碳源和能源等發(fā)揮作用，更大的可能是甲醇作為信號分子或者某些酶的特異性誘導(dǎo)物改變了纖維堆囊菌某一或者某幾個代謝途徑而導(dǎo)致了埃博霉素A和B整體產(chǎn)量的提升。
　　通過對甲醇添加時間和添加量的進(jìn)一步優(yōu)化表明，在接種前加入體積比0.05%的甲醇對埃博霉素合成的促進(jìn)作用最大最穩(wěn)定，同時發(fā)現(xiàn)甲

4、醇對埃博霉素的促進(jìn)作用與菌體的整體代謝強(qiáng)度和生產(chǎn)能力有關(guān)，當(dāng)對照組產(chǎn)量較高時，甲醇對埃博霉素的提升幅度更大，提升幅度能達(dá)到40%左右，說明甲醇提升產(chǎn)量作用具有放大效應(yīng)，這更有利于在目前已確定的穩(wěn)定高產(chǎn)量生產(chǎn)工藝的基礎(chǔ)上繼續(xù)對埃博霉素產(chǎn)量的大幅度提升。通過分子生物學(xué)手段對甲醇促進(jìn)埃博霉素合成進(jìn)行分析，纖維堆囊菌生長代謝中通用關(guān)鍵酶的RT-qPCR基因表達(dá)量差異分析表明甲醇對幾種關(guān)鍵酶的基因表達(dá)量的差異影響不明顯。繼續(xù)通過轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)差異

5、分析發(fā)現(xiàn)，甲醇的添加影響了合成埃博霉素途徑中的相關(guān)基因的表達(dá)量的上調(diào)和下調(diào)，表達(dá)上調(diào)的基因共197個，表達(dá)下調(diào)的基因共190個，對差異表達(dá)基因根據(jù)條件|log2(fold change)|和FDR＜0.05進(jìn)行顯著性篩選，發(fā)現(xiàn)甲醇組較空白組顯著上調(diào)的兩個基因分別編碼ATP依賴的分子伴侶ClpB和鈉轉(zhuǎn)運(yùn)焦磷酸酶。甲醇引起纖維堆囊菌菌體內(nèi)這兩個基因表達(dá)上調(diào)的最終結(jié)果應(yīng)該是，通過提高QS系統(tǒng)信號分子的前導(dǎo)肽修飾加工，增強(qiáng)了纖維堆囊菌合成埃博霉