埃博霉素A、B的微生物轉(zhuǎn)化及產(chǎn)物抑瘤效果研究.pdf

1、埃博霉素，作為一種16元環(huán)的大環(huán)內(nèi)酯抗生素，其抗癌活性已經(jīng)被認(rèn)可。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的埃博霉素及其衍生物水溶性并不可觀，同時(shí)該類藥物具有較嚴(yán)重的神經(jīng)毒性等副作用。一直以來(lái)，這些問(wèn)題嚴(yán)重制約了埃博霉素類藥物在臨床上的應(yīng)用。為了應(yīng)對(duì)這個(gè)問(wèn)題，本課題將利用微生物轉(zhuǎn)化的方法尋找新的埃博霉素類似物。微生物轉(zhuǎn)化是對(duì)天然化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造的一種新興技術(shù)，這種方法能夠發(fā)現(xiàn)更多的天然化合物的新型衍生物。本課題是利用土壤中的多種微生物分別對(duì)埃博霉素進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)

2、，以尋找具有轉(zhuǎn)化作用的菌株并鑒定轉(zhuǎn)化后的產(chǎn)物。研究?jī)?nèi)容主要分為四個(gè)方面。
　　首先是埃博霉素A、B的制備，本課題利用固體發(fā)酵技術(shù)對(duì)纖維堆囊菌進(jìn)行培養(yǎng)，利用大孔吸附性樹(shù)脂對(duì)纖維堆囊菌的代謝產(chǎn)物—埃博霉素進(jìn)行富集，然后使用色譜級(jí)甲醇對(duì)樹(shù)脂中的埃博霉素進(jìn)行解吸附。再利用四氯化碳對(duì)埃博霉素進(jìn)行萃取純化。利用這種方法得到的埃博霉素的總純度達(dá)95％，相比于傳統(tǒng)的埃博霉素液體發(fā)酵法產(chǎn)物萃取純度提高了40%左右。
　　第二是轉(zhuǎn)化菌種的篩選，

3、本課題中用于轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的菌株均來(lái)自于土壤。采集不同環(huán)境下的土壤樣品，進(jìn)行微生物的分離純化，建立菌種庫(kù)，將菌種庫(kù)中所有菌種均進(jìn)行埃博霉素的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，根據(jù)高效液相色譜檢測(cè)，篩選出具有轉(zhuǎn)化作用的菌種，并進(jìn)行菌種鑒定。在此設(shè)計(jì)方案下，本課題共采集23種不同環(huán)境下的土壤樣品，并分離純化得到262株菌，其中真菌112株，細(xì)菌150株。最終篩選到具有轉(zhuǎn)化作用的菌種有5株，其中1株真菌，4株細(xì)菌。對(duì)篩選到的菌種進(jìn)行分子學(xué)鑒定，這五種菌分別是伯克氏菌，巨大

4、芽孢桿菌，多粘類芽孢桿菌，克雷伯氏菌，以及煙曲霉菌。根據(jù)高效液相色譜儀檢測(cè)，共得到5種轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，其中伯克氏菌能夠?qū)２┟顾兀ˋ&B）轉(zhuǎn)化成兩種產(chǎn)物—產(chǎn)物1和產(chǎn)物2；巨大芽孢桿菌能夠?qū)２┟顾?B轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物2；多粘類芽孢桿菌和克雷伯氏菌具有相同的轉(zhuǎn)化作用，將埃博霉素（A&B）轉(zhuǎn)化為兩種產(chǎn)物—產(chǎn)物3和產(chǎn)物4；煙曲霉能夠?qū)２┟顾谹轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物5。
　　接下來(lái)本文選取伯克氏菌的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行制備并做出結(jié)構(gòu)鑒定。首先將伯克氏菌的轉(zhuǎn)化發(fā)酵進(jìn)行放

5、大處理，得到大量的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，之后利用大孔樹(shù)脂的吸附作用進(jìn)行富集，再利用色譜級(jí)甲醇浸泡樹(shù)脂進(jìn)行解吸附，最后利用制備液相色譜對(duì)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行分離和純化。對(duì)兩種產(chǎn)物和埃博霉素A&B分別進(jìn)行質(zhì)譜分析，二級(jí)質(zhì)譜分析以及1H-NMR譜，13C-NMR譜分析，綜合所有譜圖進(jìn)行對(duì)比分析，最終對(duì)產(chǎn)物1和產(chǎn)物2的結(jié)構(gòu)做出最終確認(rèn)：產(chǎn)物1是由埃博霉素B轉(zhuǎn)化而來(lái)，其
　　分子結(jié)構(gòu)是在埃博霉素B的C12-C13位的環(huán)氧環(huán)發(fā)生開(kāi)環(huán)反應(yīng)，兩個(gè)C上均連接一個(gè)羥基。

6、產(chǎn)物2是由埃博霉素A轉(zhuǎn)化而得，其分子結(jié)構(gòu)是埃博霉素A的C1位和C12至C15片段發(fā)生大環(huán)內(nèi)酯的重排反應(yīng)，原本C1-O-C15的酯鍵斷裂，C15-O-與C12位相連，C12-C13處的環(huán)氧環(huán)開(kāi)環(huán)，C13-O-與C1位相連。
　　最后對(duì)兩種轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行抑瘤效果分析。本課題選用人宮頸癌細(xì)胞—Hela細(xì)胞研究埃博霉素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物體外活性。通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)最終得到產(chǎn)物1的半數(shù)抑制率（IC50）為15.6 ng/mL，細(xì)胞抑制率為75.4%；產(chǎn)物2