葡聚糖抗原制備、篩選及Elisa分析方法的建立.pdf

1、葡聚糖是豆粕、禾谷類常用動(dòng)物飼料原料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子,也是制糖、啤酒工業(yè)的有害化學(xué)物,為了便于葡聚糖脫除方法的評(píng)價(jià),實(shí)時(shí)監(jiān)控制糖、啤酒加工過(guò)程葡聚糖的形成情況,建立一種快速、準(zhǔn)確的葡聚糖定量檢測(cè)方法十分必要。免疫分析法是根據(jù)抗體和抗原能發(fā)生特定結(jié)合而形成的分析方法,具有操作簡(jiǎn)單,靈敏度高,選擇性強(qiáng)、不需要特殊儀器和設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)。本研究以研究葡聚糖免疫抗原的合成,多克隆抗體制備及免疫分析技術(shù)為基礎(chǔ),建立了一種快速簡(jiǎn)便的葡聚糖的酶聯(lián)免疫檢測(cè)(E

2、lisa)方法。具體研究?jī)?nèi)容如下：
　　 ⑴合成了不同氧化度的氧化葡聚糖半抗原,經(jīng)過(guò)紅外光譜和紫外光譜鑒定合成產(chǎn)物:采用還原胺化法,合成了不同的葡聚糖-BAS(HSA)人工抗原,優(yōu)化反應(yīng)pH值、反應(yīng)原料比、反應(yīng)時(shí)間等反應(yīng)條件,測(cè)定抗原的接枝度,SDS-PAGE對(duì)不同抗原進(jìn)行定性與半定量表征;通過(guò)間接非競(jìng)爭(zhēng)Elisa檢測(cè)抗原與葡聚糖一抗結(jié)合的效果,結(jié)果表明:半抗原的氧化度,葡聚糖的分子量和空間結(jié)構(gòu),載體蛋白對(duì)葡聚糖-BSA(HSA

3、)抗原與葡聚糖一抗結(jié)合的效果均有很大的影響。
　　 ⑵將葡聚糖與牛血清蛋白(BSA)以Maillard法合成葡聚糖-BSA抗原,抗原測(cè)定接枝度進(jìn)行定量鑒定；通過(guò)間接非競(jìng)爭(zhēng)Elisa檢測(cè)Maillard法制備的抗原與葡聚糖一抗結(jié)合率,結(jié)果表明:反應(yīng)48h后的T100-BSA與一抗的結(jié)合率最強(qiáng),即Maillard產(chǎn)物與葡聚糖一抗的結(jié)合率不僅與糖的分子量有關(guān),并且與糖本身的特性、糖與蛋白質(zhì)結(jié)合產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)有關(guān)。
　　 ⑶通過(guò)免疫

4、新西蘭大白兔獲得的多抗以及Elisa試驗(yàn)條件的優(yōu)化,建立了葡聚糖免疫定量檢測(cè)方法。最佳檢測(cè)條件為:抗原包被濃度10μg/mL,37℃時(shí)血清多抗和酶標(biāo)多抗的反應(yīng)時(shí)間均為45min,5％小牛血清為封閉液；用間接競(jìng)爭(zhēng)Elisa方法,檢測(cè)不同分子量的葡聚糖對(duì)多抗的抑制。結(jié)果表明:不同分子量的葡聚糖均能對(duì)多抗血清產(chǎn)生抑制作用,且分子量越大的葡聚糖對(duì)多抗的抑制效果越明顯；同時(shí)市售的白糖對(duì)多抗也有一定的抑制作用,經(jīng)檢測(cè)可知,當(dāng)白糖中葡聚糖T40的濃度