毛蚶天然多肽提取純化及其體外抗氧化能力和抑制腫瘤活性的初步研究.pdf

1、毛蚶是我國重要海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)貝類，其肉質(zhì)鮮嫩、營養(yǎng)全面且具有一定的藥用功效。目前罕見對毛蚶肉中的天然生物活性成分的研究，因此對其中天然存在的活性物質(zhì)的提取及應(yīng)用做出討論，將為毛蚶的高值化利用提供基礎(chǔ)和途徑，并對挖掘其藥用前景具有十分重要的意義。本論文以新鮮毛蚶肉為原料，對毛蚶肉中的天然多肽、蛋白，利用緩沖液浸提、硫酸銨梯度鹽析得到毛蚶蛋白粗提物，再經(jīng)過超濾和凝膠層析系統(tǒng)進(jìn)一步分離純化，得到三組不同分子量段的毛蚶天然多肽。分別采用高效液相色譜法

2、和Tricine-SDS-PAGE電泳技術(shù)分析鑒定所得到的三組活性多肽的組成和分子量分布。最后對三組毛蚶多肽的體外抗氧化活性和抑制腫瘤細(xì)胞增殖能力做出了初步研究。
　　首先，進(jìn)行了毛蚶肉中抗氧化活性蛋白提取的單因素試驗。蛋白提取環(huán)境為磷酸鹽緩沖液體系（PBS），考察了三個因素：PBS緩沖液的pH值、緩沖液中NaCl濃度、料液比對毛蚶蛋白提取率和O2-·、DPPH·自由基清除率的影響。通過單因素實驗，確定最適提取條件是pH為7.0、

3、NaCl濃度為0.05 mol/L、料液比為1:2。
　　其次，采用鹽析法和超濾技術(shù)對毛蚶蛋白粗提物進(jìn)行分級分離，并運用Sephadex G-15凝膠層析進(jìn)行脫鹽純化。鹽析結(jié)果表明，30~100％飽和度硫酸銨鹽析下的提取物復(fù)溶性較好，且抗氧化活性較高。對此飽和度沉淀物復(fù)溶后通過截留分子量分別為30 kD、10 kD、3 kD的超濾膜，收集分子量段分別為Mw<3 kD、3 kD

4、肽。運用Sephadex G-15凝膠層析柱對三組毛蚶多肽脫鹽純化，收集的洗脫峰溶液經(jīng)冷凍干燥后得到毛蚶天然肽干粉：組分1（0~3 kD）、組分2（3~10 kD）、組分3（10~30 kD）。
　　分別運用高效液相色譜法和Tricine-SDS-PAGE電泳技術(shù)對三組毛蚶多肽組分進(jìn)行分子量分布的測定。HPLC實驗結(jié)果表明：組分1的多肽由五部分組成，其分子量分布為440.59 Da、721.98 Da、1252.45 Da、173

5、4.17 Da、3158.68 Da；組分2中主要由4部分組成，分子量分別約為4776.48 Da、5831.68 Da、7478.94 Da、9454.88 Da。電泳結(jié)果表明，組分3中的蛋白質(zhì)分子量較小，范圍在10~20 kDa。
　　最后，對純化的三組毛蚶天然多肽進(jìn)行了體外抗氧化活性和抑制腫瘤細(xì)胞增殖能力的初步探究。實驗結(jié)果顯示，組分1對超氧陰離子自由基和 DPPH·自由基的清除作用最好，樣品濃度5.00 mg/mL時對兩種

6、自由基清除率分別達(dá)40.54%、28.66%。MTT實驗結(jié)果顯示：組分1對肝癌細(xì)胞HepG2增殖具有一定的抑制作用；組分2對肝癌細(xì)胞HepG2增殖存在潛在的促進(jìn)作用，但必須達(dá)到特定濃度；組分3對肝癌細(xì)胞HepG2增殖沒有明顯影響。體外活性探究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，毛蚶中提純的分子量小于3kD的天然寡肽兼具良好的抗氧化活性和抗腫瘤活性，具有進(jìn)一步開發(fā)的價值和意義，以及開發(fā)成新型海洋天然藥物的潛力。
　　綜上，本文首次對毛蚶中天然存在的小分子多肽