雙砷染料-四半胱氨酸系統(tǒng)在蛋白質(zhì)標(biāo)記檢測(cè)以及定量分析方面的應(yīng)用.pdf

1、研究蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的定位、分布,以及含量變化對(duì)了解其功能,揭示其作用機(jī)制具有重要意義。以綠色熒光蛋白為代表的生物標(biāo)簽將細(xì)胞顯影方面的研究推向了高潮。但是由于空間效應(yīng)的限制,熒光蛋白及其衍生物也表現(xiàn)出了其固有的局限性。這樣,許多化學(xué)小分子熒光標(biāo)簽得到了廣泛的發(fā)展和應(yīng)用。雙砷染料-四半胱氨酸(TC)系統(tǒng)就是其中的成功者。該系統(tǒng)不僅能用于活細(xì)胞體內(nèi)的研究和分析,而且具有許多其它優(yōu)點(diǎn):(1)體積較小,不會(huì)影響到標(biāo)記蛋白的物理折疊和生物活性。(2

2、)特異性高,背景信號(hào)低。(3)能夠作為定量分析工具使用。雖然TC標(biāo)簽被廣泛的應(yīng)用,但是染料與TC模體之間在極端條件下的結(jié)合穩(wěn)定性以及其在定量分析方面的潛力,依然值得關(guān)注。
　　 本研究以烯酰.?；d體蛋白(ACP)還原酶(FabⅠ)為例,對(duì)該問(wèn)題進(jìn)行了系統(tǒng)的探索。FabⅠ是細(xì)菌脂肪酸生物合成途徑中催化延伸反應(yīng)最后一步還原反應(yīng)的酶,也是篩選新型抗菌藥物的重要靶點(diǎn)。在此,我們分別構(gòu)建了N端、C端、或者兩端帶TC標(biāo)簽的FabⅠ,以及N

3、端帶增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)標(biāo)簽的FabⅠ和沒(méi)有標(biāo)記的FabⅠ作為研究對(duì)象(分別記為Nt-FabⅠ、Ct-FabⅠ、Bt-FabⅠ、Gt-FabⅠ和Wt-FabⅠ)。通過(guò)體外酶活力測(cè)試,表明EGFP標(biāo)記的FabⅠ失去了酶活力,而帶有TC標(biāo)簽的FabⅠ與野生型的FabⅠ(Wt-FabⅠ)一樣具有明顯的酶活力。這表明TC標(biāo)簽沒(méi)有影響靶蛋白的功能。純化的Fabls與雙砷染料結(jié)合后酶活力均有所下降,而尤以Wt-FabⅠ下降最為明顯。此外,

4、我們還分別在加熱、高壓(由高效液相色譜HPLC提供)、高場(chǎng)強(qiáng)(由毛細(xì)管電泳CE提供)、微波處理和超聲波處理等環(huán)境下檢測(cè)了染料與TC標(biāo)簽的結(jié)合穩(wěn)定性。結(jié)果表明,在70℃加熱10 min,在5.24 MPa的高壓下,在397 V/cm的高場(chǎng)強(qiáng)以及80 W的超聲波處理30 min等條件下,二者之間的結(jié)合是穩(wěn)定的。而微波(750 W)對(duì)染料與標(biāo)簽之間的結(jié)合所表現(xiàn)出的破壞作用隨時(shí)間而增強(qiáng)。當(dāng)處理時(shí)間達(dá)15 min時(shí),能觀察到明顯的破壞作用,當(dāng)處理

5、時(shí)間延長(zhǎng)至25 min時(shí)幾乎完全破壞了二者之間的結(jié)合。在此基礎(chǔ)上,我們探討了TC標(biāo)簽在不同條件下對(duì)靶蛋白的定量分析的檢測(cè)限和靈敏度。在毛細(xì)管區(qū)帶電泳(CZE)條件下,對(duì)TC標(biāo)記的FabⅠ檢測(cè)限達(dá)到10-16 mol,在10-12～10-10 mol濃度范圍內(nèi),呈明顯的線性關(guān)系。在SDS-PAGE膠上,檢測(cè)限低至1 ng(10-11 mol)。而直接用熒光分光光度計(jì)檢測(cè),檢測(cè)限達(dá)到10-12 mol。這些充分說(shuō)明了TC標(biāo)簽在靶蛋白的定量分

6、析方面具有十分巨大的潛力。
　　 同時(shí),我們又用TC標(biāo)簽對(duì)大腸桿菌超量表達(dá)的?；d體蛋白(holo-ACP)進(jìn)行了定量分析。在細(xì)菌中,直接由acpP基因表達(dá)的是沒(méi)有活性的apo-ACP,只有經(jīng)過(guò)?；d體蛋白合成酶(AcpS)的修飾后才能成為有活性的holo-ACP,在脂肪酸的生物合成中傳遞各種中間產(chǎn)物。在這部分工作中,我們構(gòu)建了四種表達(dá)菌株Hh02:BL21(DE3),pB-lu-ACP&pET-AcpS;Hh04:BL21(D

7、E3)/pB-lu-ACP-AcpS;Hh06:BL21(DE3)/pB-lu-ACP-AcpS&pET-AcpS；Hh08:BL21(DE3)/pB-lu-ACP。四種表達(dá)菌株帶有的不同質(zhì)?？梢允辜?xì)胞內(nèi)的apo-ACP和holo-ACP以不同的比例存在,這樣可以方便后續(xù)的分析檢測(cè)。試驗(yàn)中用膠束電動(dòng)毛細(xì)管電色譜(MEKC)來(lái)分析各菌株誘導(dǎo)表達(dá)后細(xì)胞裂解液中的apo-ACP和holo-ACP。結(jié)果表明在電泳條件下這兩種在SDS-PAGE膠