6-APA MISPE-HPLC檢測牛奶中青霉素類抗毒殘留的研究.pdf

1、青霉素類抗生素目前廣泛應用于奶牛乳腺炎的預防和治療，如果濫用、使用不當或不遵守休藥期規(guī)定，均可造成此類抗生素殘留。殘留在牛奶中的抗生素，不僅會影響牛奶的品質，甚至會危害人體健康，抗生素殘留已經(jīng)成為國際貿(mào)易的綠色壁壘。動物源性食品中抗生素殘留的前處理及檢測技術日益受到國際社會的重視，而抗生素的多殘留同時提取檢測的研究顯得尤為重要。
　　 本研究旨在采用青霉素類抗生素中間體6-氨基青霉烷酸(6-aminopenicillanicac

2、id，6-APA)為虛擬模板，制備青霉素類(PENs)的新型分子印跡固相萃取柱，從復雜基質的生物樣品中同時提取殘留的多種青霉素：青霉素G鉀(penicillinG，PEN)、氨芐青霉素(ampicillin，AMP)和阿莫西林(amoxicillin，AMO)及中間體6-APA，并用高效液相色譜進行同時分離檢測，建立一種6-APA分子印跡固相萃取-高效液相色譜的檢測方法(MISPE-HPLC)，為含復雜基質樣品中痕量分析物的檢測提供了新

3、型的樣品前處理及檢測技術。同時建立了檢測該4種藥物的超高效液相色譜-質譜聯(lián)用(UPLC-MS/MS)的檢測技術，為以后作進一步研究打下基礎。
　　 具體研究內(nèi)容如下：
　　 1、6-APA分子印跡聚合物以及分子印跡固相萃取柱的制備
　　 以青霉素母核6-APA為模板分子、α-甲基丙烯酸為功能單體(MAA)、乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑(EDMA)、引發(fā)劑(AIBN)(聚合比例為1:5:30:0.3)，并以甲酸作為

4、致孔劑采用沉淀聚合法制備非共價印跡聚合物，并利用紅外光譜和掃描電鏡對該非共價印跡聚合物的結構和形貌進行表征，采用靜態(tài)吸附實驗研究此印跡聚合物的吸附性能。Scachard分析表明：此印跡聚合物對3種模板分子類似物-AMO、PEN、AMP具有較大的表觀吸附容量。
　　 用制備好的分子印跡聚合物作為吸附劑同硅藻土以2:1的比例裝填入空的SPE柱中，制備成分子印跡固相萃取柱(MISPE)。并通過考察不同活化劑和洗脫劑對MISPE柱的影響

5、，選擇最佳活化劑和洗脫劑，方法的回收率均83.5％～87.27％之間。
　　 2、4種PENs高效液相色譜方法的建立
　　 建立了高效液相色譜(HPLC)同時檢測牛奶中青霉素類抗生素中間體6-APA及3種青霉素類藥物：氨芐青霉素(AMP)、阿莫西林(AMO)和青霉素G鉀(PEN)，的方法。用Xterra()MSC18柱，考察了不同流動相的種類和配比對分離效果的影響，確立以乙腈-0.1％氨水(5:95)為流動相，檢測波長為

6、200nm。6min內(nèi)可實現(xiàn)4種青霉素類抗生素(PENs)的快速分離檢測。方法在0.125～10mg/L范圍內(nèi)有良好的線性，相關系數(shù)為r2=0.9972～0.9993，相對標準偏差(RSD，n=6)為2.01％～2.22％。
　　 3、4種PENs高效毛細管電泳方法的建立
　　 建立了高效毛細管電泳(HPCE)同時檢測牛奶中青霉素類抗生素中間體6-氨基青霉烷酸(6-APA)以及3種青霉素類藥物青霉素G鉀(PEN)、氨芐青

7、霉素(AMP)和阿莫西林(AMO)的方法。利用正交實驗設計，對HPCE中的緩沖液離子濃度，pH值，分離電壓，分離溫度等分離條件進行了優(yōu)化。確立了以40mmol/L磷酸二氫鉀-20mmol/L硼砂為電泳緩沖液(pH7.8)，分離電壓為28kV，分離溫度為30℃，4.5min內(nèi)可實現(xiàn)4種青霉素類藥物(PENs)的快速分離檢測。各組分在1.56～100mg/L范圍內(nèi)有良好的線性，相關系數(shù)r2為0.9979～0.9998，相對標準偏差(RSDs

8、)為1.20％～1.93％(n=6)?？捎糜诜肿佑≯E聚合物制備過程中的檢測。
　　 4、6-APAMISPE-HPLC檢測方法的建立
　　 以制備的6-APAMISPE柱為對象，考察了MISPE柱活化溶劑的種類，洗脫劑的種類和用量對樣品中6-APA以及模板類似物回收率的影響。建立了以10mL3.2g/L溴化四丁基銨乙腈提取，并以3mL80％甲醇水溶液作為活化溶劑，以3mL乙腈-甲醇(v：v=3:7)作為洗脫劑進行凈化的前

9、處理方法，方法的回收率均在83.5％～87.27％之間。將牛奶中青霉素類藥物最佳的前處理方法與高效液相色譜檢測方法聯(lián)用，確立了牛奶中青霉素類抗生素6-APAMISPE-HPLC的檢測方法。
　　 研究結果表明：建立的MISPE-HPLC方法選擇性好，精密度、準確度高。建立的4min內(nèi)同時測定4種PENs的高效液相色譜方法簡便、快速、易行。對于檢測牛奶及動物源性食品中獸藥的殘留檢測新方法的創(chuàng)建具有非常重要的探索性意義和實用意義。<

10、br>　　 5、UPLC-MS/MS方法的建立
　　 超高效液相色譜條件的建立：應用AgilentC18(2.1×150mm，5μm)色譜柱，分別比較了不同流動相配比情況下對4種物質分離效果的影響，最終確定流動相配比為：75％水-25％乙腈時分離效果最佳。
　　 質譜條件的建立：電噴霧離子源(ESI)；離子化模式：負離子掃描模式；毛細管電壓：4000V；霧化氣壓力：35psi；干燥氣流量：9.5L/min；干燥氣溫度：