卷曲乳桿菌益生特征及黏附機(jī)理研究.pdf

1、乳桿菌是人和動物腸道的正常菌群，具有維持腸道內(nèi)菌群平衡，提高機(jī)體免疫力，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)吸收等生理功能。同時乳桿菌在生長過程中，能夠產(chǎn)生乳酸、乙酸、過氧化氫、細(xì)菌素等抑菌物質(zhì)，對腸道病原菌有抑制作用，因此，乳桿菌對機(jī)體具有重要的益生作用。益生菌的篩選標(biāo)準(zhǔn)包括黏附和定植能力、無致病性、對病原菌有拮抗作用、不攜帶可轉(zhuǎn)移的抗生素基因等。其中，對消化道表面的黏附和定植能力是重要的篩選指標(biāo)，其黏附能力決定于細(xì)胞表層蛋白的組成及疏水特性。另外，益生菌對

2、病原菌具有抑制作用，作用機(jī)制包括競爭有限的資源限制病原菌的生長、競爭病原菌黏附位點、分泌抗菌物質(zhì)及失活毒素等。因此臨床上應(yīng)用益生菌劑來預(yù)防或治療因抗藥性病原菌引起的腸道感染及腹瀉等疾病。但是目前大部分的研究只停留在作用效果上，缺乏對益生菌作用機(jī)理的研究。為了深入研究益生菌的作用機(jī)理，篩選功能明確、安全性高的益生菌，本文主要圍繞高黏附乳桿菌的篩選、乳桿菌對病原菌黏附上皮細(xì)胞的抑制作用、黏附蛋白的結(jié)構(gòu)和功能鑒定、乳桿菌抗生素抗性評價、乳桿菌

3、表達(dá)載體構(gòu)建五個方面展開研究，其結(jié)果如下:
　　 1.高黏附乳桿菌的篩選及益生特性的體外評價
　　 目前乳酸菌的益生作用已被人們所接受。在畜禽養(yǎng)殖業(yè)，益生菌劑替代抗生素以促進(jìn)動物的生長已得到認(rèn)可，但目前仍存在菌株單一、特異性不強(qiáng)等問題，因此優(yōu)良益生菌株的選育是開發(fā)益生菌制劑的關(guān)鍵。本文將分離自健康雞腸道的42株乳桿菌與結(jié)腸癌細(xì)胞系HT-29共同溫浴，結(jié)果6株乳桿菌具有較高的黏附能力，經(jīng)16SrDNA基因序列分析，分別鑒定

4、為Lactobacillus crispatus K313、Lactobacillus crispatus K243、Lactobacillus helveticus 2020T、Lactobacillus johnsonnii H31、Lactobacillus salivarius Z4、Lactobacillus salivarius K233。其中，Lb.crispatus K313黏附能力最強(qiáng)，黏附量為73.2bacteria

5、/cell。隨后將這6株乳桿菌與黏蛋白(mucin)、胞外基質(zhì)蛋白Ⅰ型膠原(CnⅠ)、Ⅳ型膠原(CnⅣ)和纖連蛋白(FN)共同溫育，結(jié)果菌株Lb.crispatus K243和K313表現(xiàn)出較高的黏附能力，其中Lb.crispatusK243與CnⅣ結(jié)合能力最高，結(jié)合量為1239bacteria/field。菌株Lb.crispatus K243和K313對酸和膽鹽表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐受力，在pH3.5的酸性環(huán)境中仍能緩慢生長，在0.1％的牛

6、膽鹽中培養(yǎng)6h，活菌數(shù)基本不變。Lb.crispatusK313和K243還具有膽固醇降解能力，膽固醇脫出率分別為60.8％和51.4％。Lb.crispatus K313和K243對正十六烷、氯仿的親和力高達(dá)90％，而對乙酸乙酯的結(jié)合能力較弱，說明它們都具有疏水性的、堿性的細(xì)胞表面。透射電鏡觀察菌株K243和K313的超微結(jié)構(gòu)顯示，這2株菌的細(xì)胞壁表面都存在S層蛋白，用LiCl提取菌株K243和K313的S層蛋白，SDS-PAGE分析

7、顯示其大小分別為45kDa和60kDa，將其命名為SlpA和SlpB。用LiCl、蛋白酶K、胃蛋白酶、胰蛋白酶處理菌體細(xì)胞，SDS-PAGE分析顯示SlpB對胃蛋白酶敏感，對胰蛋白酶不敏感，而SlpA對胃蛋白酶和胰蛋白酶都不敏感。經(jīng)過LiCl處理后，Lb.crispatus K243和K313對膠原蛋白和HT-29細(xì)胞的黏附能力都明顯下降，并且純化的S層蛋白也能阻礙Lb.crispatus K243和K313對CnⅣ和HT-29細(xì)胞的黏

8、附，說明S層蛋白參與了黏附過程。用LiCl處理菌株后，Lb.crispatus的形態(tài)變?yōu)闄E圓或不規(guī)則狀，表明S層蛋白對維持細(xì)胞正常形態(tài)發(fā)揮重要作用。去除S層蛋白后，這2株菌的存活率及對人工胃腸液的耐受性降低，說明S層蛋白可以保護(hù)宿主菌免受不利環(huán)境的影響。通過以上特性的研究，說明這2株菌具有益生菌的優(yōu)良特性，可作為益生菌展開后續(xù)工作的研究。
　　 2.Lb.crispatus調(diào)節(jié)病原菌感染HT-29細(xì)胞所引起的炎癥反應(yīng)
　　

9、 益生菌能預(yù)防和治療因病原菌感染造成的腹瀉等疾病，其作用機(jī)制包括減少病原菌定植，調(diào)節(jié)腸道菌群平衡及促進(jìn)宿主免疫反應(yīng)。益生菌一般通過共絮凝、競爭排斥等抑制病原菌的定植，本文研究表明，Lb.crispatusK313與病原菌Salmonella.braenderup H9812和EscherichiacoliATCC25922的共絮凝率分別為57.7％和84.8％，而Lb.crispatus K243與它們的共絮凝率分別為28.7％和26

10、.2％，明顯低于Lb.crispatus K313。隨后將菌株K313和K243與S.braenderup H9812和E.coliATCC25922共同感染HT-29細(xì)胞，結(jié)果Lb.crispatus K243和K313都能降低S.braenderupH9812和E.coliATCC25922對HT-29細(xì)胞的黏附能力，并且菌株K313比K243表現(xiàn)出更強(qiáng)的抑制能力，此結(jié)果與共絮凝作用相吻合。當(dāng)S.braenderupH9812單獨感

11、染HT-29細(xì)胞時，促炎性細(xì)胞因子IL-8、CXCL1和CCL20的轉(zhuǎn)錄水平是上調(diào)的，而當(dāng)Lb.crispatus與S.braenderupH9812共同感染時，K313和243下調(diào)了IL-8的轉(zhuǎn)錄水平，下調(diào)幅度分別為42％和37％。另外，K313還下調(diào)了CXCL1和CCL20的轉(zhuǎn)錄水平，下調(diào)幅度為63％和41％。ELISA分析進(jìn)一步驗證了IL-8的分泌水平，結(jié)果表明Lb.crispatus K243和K313都能抑制由S.braend

12、erup H9812感染HT-29所誘導(dǎo)的IL-8的分泌，抑制量分別為32.8％和47.0％。上述實驗結(jié)果說明，Lb.crispatus K243和K313具有消弱S.braenderup H9812感染上皮細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)的能力，為益生菌在臨床上的潛在應(yīng)用提供了理論參考。
　　 3.Lb.crispatus K313S-layer蛋白相關(guān)功能域研究
　　 如上所述，S層蛋白介導(dǎo)Lb.crispatus K313與HT-

13、29細(xì)胞和膠原蛋白的黏附。為進(jìn)一步闡明黏附機(jī)制，采取2種方法克隆了Lb.crispatus K313的S層蛋白基因:首先根據(jù)已報道S層蛋白基因序列，設(shè)計引物擴(kuò)增S層蛋白的保守區(qū)，并結(jié)合ligation-anchored PCR擴(kuò)增保守區(qū)的上下游序列，經(jīng)拼接后得到S層蛋白基因全長，將其命名為slpA。第二種方法提取表層蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE分析，分離SDS-PAGE上的S層蛋白，并進(jìn)行N端測序，根據(jù)得到的氨基酸序列設(shè)計簡并引物，結(jié)合l

14、igation-anchored PCR和TailPCR擴(kuò)增上下游序列。拼接后進(jìn)行Blast比對共得到兩個相鄰的S層蛋白基因，命名為slpB和slpC。利用RealTimePCR分析slpA、slpB和slpC的表達(dá)模式，結(jié)果顯示在檢測條件下slpA是沉默的，slpB的轉(zhuǎn)錄水平是slpC的170倍左右，因此SlpB是Lb.crispatus K313中優(yōu)勢表達(dá)的S層蛋白。序列同源性比對顯示，SlpB與SlpC氨基酸序列與所報道的卷曲乳桿

15、菌S層蛋白氨基酸序列同源性較低。在slpB啟動子下游有一段長約190bp的非翻譯區(qū)UTLS，利用DNA重組技術(shù)將UTLS去除造成下游蛋白產(chǎn)量下降一半，說明UTLS對S層蛋白的高效表達(dá)至關(guān)重要。將SlpB截成一系列大小不等的片段，利用ELISA技術(shù)分析不同片段對胞外基質(zhì)蛋白CnⅠ、CnⅣ、FN的結(jié)合能力，結(jié)果顯示rSlpB1-501與CnⅣ和CnⅠ有顯著水平的結(jié)合，分別是BSA的5.8和3.8倍，而不能結(jié)合FN。肽段rSlpB1-359與

16、rSlpB1-379與CnⅠ、CnⅣ都有顯著水平的結(jié)合，這說明與膠原蛋白結(jié)合功能域位于SlpB的N端。rSlpB1-359與膠原蛋白的結(jié)合能力相對于rSlpB1-379明顯降低，將360-364五個氨基酸“VTVNV”中疏水氨基酸突變?yōu)橛H水氨基酸“TTTNT”，突變后的rSlpB1-379與膠原蛋白結(jié)合能力下降，說明這五個氨基酸對SlpB與膠原蛋白的結(jié)合能力至關(guān)重要。將截斷的片段分別與GFP融合表達(dá)，利用熒光酶標(biāo)儀鑒定不同片段與細(xì)胞壁的

17、錨定功能。結(jié)果顯示SlpB細(xì)胞壁錨定結(jié)構(gòu)域位于C端。用10％TCA處理去除細(xì)胞壁中磷壁酸成分，SlpB與細(xì)胞壁的結(jié)合能力下降60％，因此SlpB的結(jié)合受體可能是磷壁酸。rSlpB323-501-GFP與不同乳桿菌細(xì)胞壁的結(jié)合能力不同，對于本身具有S層蛋白的乳桿菌，SlpB與其有較高的結(jié)合能力，并且LiCl預(yù)處理能明顯提高菌株與rSlpB323-501-GFP的結(jié)合量，對不含有S層蛋白的菌株，無論經(jīng)過LiCl處理與否，它們與rSlpB32

18、3-501-GFP的結(jié)合量都非常低。因此SlpB與乳桿菌細(xì)胞表面的結(jié)合能力取決于乳桿菌本身是否含有S層蛋白。
　　 4.卷曲乳桿菌抗藥性評價
　　 除了營養(yǎng)功能和益生作用，益生菌不能對人體或動物有任何負(fù)面效應(yīng)，這就需要對益生菌進(jìn)行安全性評價。其中，抗生素抗性是重要的評價指標(biāo)?？股乜剐曰蛐头治霰砻?，Lb.crispatusK313攜帶氯霉素抗性基因cat、紅霉素抗性基因ermB和四環(huán)素抗性基因tetL、tetM,而菌株

19、K243攜帶有tetL、tetM抗性基因?？寺b.crispatusK313中的tetL、tetM基因，系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示TetL與已報道的TetL同源性較低，以高的自展值(100％)形成獨立的分支。而TetM與已報道的TetM同源性較高，以97％的自展值聚類在一起。為進(jìn)一步分析抗性基因的可轉(zhuǎn)移性，以Lb.crispatusK243和K313為供體菌，EnterococcusfaecalisK9為受體菌，采用濾膜雜交法，在含有抗生素平

20、板上均沒有篩選到抗性菌株，說明這2個菌株攜帶的抗性基因均不能轉(zhuǎn)移到EnterococcusfaecalisK9中，初步推斷Lb.crispatusK243和K313在腸道內(nèi)抗性相對穩(wěn)定。
　　 5.乳桿菌表達(dá)載體構(gòu)建
　　 以上實驗均是在體外評價Lb.crispatus K243和K313的益生作用，為了在體內(nèi)研究其定植、生長繁殖的動態(tài)變化，擬進(jìn)行菌株熒光標(biāo)記，通過質(zhì)粒載體攜帶熒光蛋白基因在益生菌內(nèi)有效表達(dá)，實時監(jiān)測益生

21、菌在動物體內(nèi)的生長狀態(tài)。鑒于目前乳桿菌質(zhì)粒載體的不完善，本文分離和測序了植物乳桿菌的隱秘型質(zhì)粒pD403，結(jié)果表明，pD403質(zhì)粒全長2791bp，GC含量37％，含有兩個開放閱讀框orf1和orf2。ORF1含有318個氨基酸經(jīng)比對其為一復(fù)制起始蛋白RepA。ORF2含有137個氨基酸，與Ralstoniapickettii 12D的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白TrmB有31％的同源性。功能鑒定顯示ORF2(Tra)對質(zhì)粒在宿主菌中的復(fù)制不起決定性作

22、用，但是Tra能明顯提高質(zhì)粒載體的轉(zhuǎn)化率。pD403復(fù)制起始位點同源性比對顯示pD403可能是一個滾環(huán)復(fù)制型質(zhì)粒，并且RepA的同源性比對結(jié)果表明RepA與滾環(huán)復(fù)制第三家族的復(fù)制起始蛋白同源性較高。將pD403的復(fù)制子、氯霉素抗性基因、大腸桿菌克隆載體pUC19的復(fù)制子依次連接構(gòu)建大腸桿菌/乳桿菌穿梭克隆載體pCD4032。檢測了pCD4032的宿主范圍，發(fā)現(xiàn)pCD4032能成功轉(zhuǎn)化Lb.casei、Lb.plantarum、Lb.fe

23、rmentum和Lb.brevis，轉(zhuǎn)化效率從1.3×102到7×104轉(zhuǎn)化子/μgDNA。擴(kuò)增Lb.delbrueckiisubsp.bulgaricusATCC11842的乳酸脫氫酶啟動子和終止子序列，并插入到pCD4032中構(gòu)建表達(dá)載體pCD4033。以綠色熒光蛋白基因（gfp）為報告基因，將其連接到載體pCD4033啟動子下游，獲得重組質(zhì)粒pCD4033-gfp，然后重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化乳桿菌感受態(tài)細(xì)胞。在熒光顯微鏡下，所有的重組菌株