慢病毒載體用于眼部基因轉(zhuǎn)移的實驗研究.pdf

1、目的： 以慢病毒(Lentivirus,LV)為載體介導(dǎo)報告基因和外源基因轉(zhuǎn)移，觀察其體外感染效率，病毒滴度及感染時間對感染效率的影響以及對視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的毒性作用。評價LV介導(dǎo)的報告基因GFP和Endostatin基因眼部轉(zhuǎn)移的作用效果，探討將外源基因轉(zhuǎn)入視網(wǎng)膜組織的可行性，為今后慢病毒載體用于眼部新生血管性疾病的治療提供前期研究基礎(chǔ)。 方法： 含綠色熒光蛋白(green fluorescent prote

2、in,GFP)和內(nèi)皮抑素(Endostatin,ES)兩種外源基因及巨細(xì)胞病毒(cytomegalovirus,CMV)和視紫紅質(zhì)(rhodopsin,Rho)兩種不同啟動子的LV載體，在體外感染人視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)細(xì)胞，眼內(nèi)行玻璃體腔注射。通過檢測細(xì)胞表達GFP的比例和熒光強度及ES mRNA水平來評價其感染效率；通過透射電鏡和甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl

3、 tetrazolium,MTT)試驗，了解LV載體對RPE細(xì)胞的毒性作用。通過觀察視網(wǎng)膜熒光來評價其在眼部的轉(zhuǎn)染效果。建立小鼠ROP模型，觀察新生血管的形態(tài)和數(shù)量。 結(jié)果： 隨病毒滴度增加和感染時間延長，表達GFP的RPE細(xì)胞數(shù)和熒光強度增加；隨病毒滴度增加，RPE細(xì)胞內(nèi)ES mRNA增加。一定劑量范圍內(nèi)病毒對細(xì)胞增殖及超微結(jié)構(gòu)無明顯影響。LV通過玻璃體腔注射介導(dǎo)GFP基因轉(zhuǎn)移可見視網(wǎng)膜熒光表達。小鼠ROP模型中視網(wǎng)膜