豆豉溶栓酶基因在乳酸桿菌中的表達.pdf

1、乳酸菌(Lactic acid bacteria，LAB)是食品微生物的重要成員。由于它對人和動物健康有益，因此它在食品及醫(yī)藥工程領域具有重要應用前景。乳酸菌中存在大量染色體外的遺傳物質，為其克隆載體系統(tǒng)的發(fā)展提供了極好的材料。近10多年來，隨著乳酸菌內源性質粒的去除和電穿孔技術的建立以及乳酸菌中表達信號的分離，已建立和發(fā)展了一系列具有不同用途的乳酸菌載體和受體系統(tǒng)。這些載體包括克隆載體、整合載體及表達載體，而食品級基因表達載體的研究則

2、是近年來該領域的前沿和熱點。食品級表達載體利用食品級的選擇標記替代了傳統(tǒng)的抗生素抗性選擇標記，這就避免了將抗生素抗性基因投放到環(huán)境中或人和動物體內。因此，乳酸菌食品級載體的研究與開發(fā)具有重要意義。 本研究以LacF基因為選擇標記，構建了乳酸桿菌食品級表達系統(tǒng)，并進而實現(xiàn)了豆豉溶栓酶基因在乳酸桿菌中的表達。首先以pRY300為出發(fā)載體，構建了含有Latobacillus caseiATCC393乳糖操縱子LacF和LacG片段的整

3、合型表達載體pRVGF。利用T4DNA聚合酶消除pRVGF中LacF基因的Sph I位點，構建了LacF基因編碼區(qū)移碼突變的質粒pRVGAF，并將其電導入．L．casei ATCC393中。通過與L．casei ATCC393乳糖操縱子之間的同源雙交換，篩選到了LaeF<'->基因突變的受體菌株L．casei MBL25(LacF<'->)，并經PCR和Lae表型所驗證。利用乳酸桿菌乳糖操縱子基因啟動子構建了自主復制型載體pIAbeta

4、-plac。將豆豉溶栓酶不同肽段編碼序列分別插入到整合型載體和復制型表達載體中，共構建了6個豆豉溶拴酶基因的表達質粒。將重組表達質粒pRVGF-BADFE(含豆豉溶栓酶成熟肽編碼序列電轉化L．casei MBL25后，篩選到所需的菌株MBL26。PCR分析結果顯示，豆豉溶栓酶基因已經整合到L.casei MBL26染色體中，Lac<'+>表型也得到恢復。表明L.caseiMBL25中LacF基因的功能能被質粒pRVGF-BADFE上的L