含有紅色熒光報告基因玉米CobA的T載體和表達載體構(gòu)建研究.pdf

1、獨創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的論文是我個人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)或其它教育機構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻均已在論文中作了明確的說明并表示了謝意。研究生簽名：至￡：!蒸薹時間：甲厶年占月易日關(guān)于論文使用授權(quán)的說明本人完全了解安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定

2、，即：學(xué)校有權(quán)保留送交論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。同意安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)可以用不同方式在不同媒體上發(fā)表、傳播學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容。(保密的學(xué)位論文在解密后應(yīng)遵守此協(xié)議)研究生簽名：璽絲!疰羞研究生簽名：絲!施亟第一導(dǎo)師簽名時間：爐／年6只卜Et時間：矽／。年鄉(xiāng)月／日摘要尿卟啉原III甲基化酶(Uroporphyrinogenmethyltransferase，UPMT)是

3、維生素B12的分支合成關(guān)鍵酶，也是一種新型熒光蛋白。但是，和綠色熒光蛋白相比，它的應(yīng)用研究報道較少。本文以玉米UPMT作為篩選標記，分別研究了基因插入和融合表達對重組大腸桿菌菌落紅色熒光的影響，取得如下結(jié)果：1分析了玉米UPMT編碼基因cobA在大腸桿菌不同啟動子下的本底表達。結(jié)果表明：cobA基因在Lac，T5，Trc和Tac啟動子下均有本底表達，轉(zhuǎn)化菌斑呈紅色；但是，它在T7和araBAD啟動子下無本底表達。2分析了玉米UPMT編碼

4、基因cobA在Lac啟動子下不同菌株的表達水平。結(jié)果表明：DH5a、JMl09、XLBlucl和TGl菌株形成的菌斑，長紫外燈下菌落熒光沒有明顯差異。3構(gòu)建了基于玉米UPMT插入失活的大腸桿菌T載體，分析了不同長度片段的插入效果和插入一個500bp片段的克隆效率。結(jié)果表明：250bp，370bp，420bp，1000bp和1800bp不同長度片段均能裝入該T載體。該T載體中插入TCA三核苷酸，編碼一個Ser殘基(為T載體中TXA編碼分子

5、量最小的氨基酸殘基)，導(dǎo)致重組菌落紅色熒光消失。凝膠電泳檢測結(jié)果表明，500bp插入的克隆效率為92％，和傳統(tǒng)的基于a肽插入失活的T載體克隆效率相似。4初步分析了插入失活的機制。在T載體中插入一個Ser殘基的突變體導(dǎo)致UPMT蛋白突變體表達為包涵體，表明插入?yún)^(qū)域參與重組蛋白的折疊。5利用定點突變構(gòu)建3個麥芽糖結(jié)合蛋I蘭t(MBP)的突變體，即折疊缺陷型(G32D)、兩種包涵體類型(分別為A264D和G32D／133P)。它們的的C端分別

6、融合表達Q肽，電泳分析結(jié)果表明：A264D，G32D／133P兩個突變體蛋白均在沉淀中表達，而折疊缺陷型G32D突變體蛋白在上清和沉淀中都有表達。6利用野生型和突變體MBP的C端Q肽所具有的B一半乳糖苷酶活性，檢測蛋白的折疊和水溶性。結(jié)果表明，兩者呈高度正相關(guān)。7用UPMT分別取代野生型和突變體MBP的C端0【肽。熒光分析結(jié)果表明：它與MBP的折疊和水溶性呈現(xiàn)正相關(guān)，和0【肽活性檢測的結(jié)果一致。綜上所述，玉米UPMT作為篩選標記，在構(gòu)建