GAP—43和紅色熒光蛋白融合基因重組腺相關(guān)病毒載體的構(gòu)建及表達(dá).pdf

1、目的 建立攜帶生長(zhǎng)相關(guān)蛋白一43(growthass∞iatedprotein，GAP43)和紅色熒光蛋白(rednuorescemprotein，RFP)基因的重組腺相關(guān)病毒(recombinantadeno—associatedvirus，rAAV)載體，為進(jìn)一步以基因治療途徑研究GAP43對(duì)大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinalg鋤glioncells，RGC)損傷修復(fù)的影響奠定基礎(chǔ)，并探討REP作為報(bào)告基因的優(yōu)勢(shì)。

2、 方法 以pDsRedl-C1質(zhì)粒為模板，聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreacti∞PCR)擴(kuò)增R即編碼序列：DNA片斷；將重組質(zhì)粒pAAV—GAP43-EG即和REP基因分別用SalⅠ和BglⅡI雙酶切，純化回收后的pAAV-GAP43和RFP經(jīng)T4DNA連接酶連接構(gòu)建pAAV-GAP43-RFP。采用菌落PCR篩選陽(yáng)性克隆，限制性內(nèi)切酶分析和DNA測(cè)序確證插入DNA序列的正確性及開放讀碼框的正確性；采用脂質(zhì)體

3、法將pAAV-GAP43-RFP及另外兩種輔助質(zhì)粒pHelper和pAAV-RC共轉(zhuǎn)染AAV293細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察GAP43一RFPP融合蛋白的表達(dá)。 結(jié)果 1．PCR擴(kuò)增RFP開放讀碼框：以pDsRedl．C1為模板，紅色熒光蛋白引物進(jìn)行PCR，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1．2％的瓊脂糖凝膠中電泳，結(jié)果在預(yù)期位置有特異性擴(kuò)增的目的片斷(680bp)。 2．pAAV-GAP43-RFP載體的構(gòu)建：將目的基因R即和載體

4、pAAVGAP43-EGFP分別用SalI和BglII進(jìn)行酶切，回收后行連接反應(yīng)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Eco1.00H5Q：菌落PCR篩選獲得陽(yáng)性重組體；SalⅠ和BglⅡ雙酶切分析及DNA測(cè)序結(jié)果證明插入片斷的序列及開放讀碼框完全正確。 3．GAP43一RFP融合蛋白在293細(xì)胞的表達(dá)：將pAAV-GAP43-RFP和pAAV—RC、pHelper質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染AAV-293細(xì)胞，24h后熒光顯微鏡下即可見紅色熒光布滿整個(gè)細(xì)胞核，48h后