含雙熒光報(bào)告基因的轉(zhuǎn)基因載體的應(yīng)用.pdf

1、綠色熒光蛋白與紅色熒光蛋白自發(fā)現(xiàn)以來(lái)，就因易于檢測(cè)、熒光穩(wěn)定、無(wú)毒害、種屬通用性、易于構(gòu)建載體、可進(jìn)行活細(xì)胞定位定時(shí)觀察等特性而得到廣泛應(yīng)用。其應(yīng)用領(lǐng)域涉及生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域，包括研究基因表達(dá)的調(diào)控元件、增強(qiáng)子捕獲、蛋白定位、研究基因表達(dá)的時(shí)空特性和空間定位、發(fā)育分子機(jī)理、篩選藥物、臨床檢驗(yàn)、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和植物的篩選標(biāo)記以及對(duì)病毒顆粒定位、蛋白質(zhì)相互作用等方面。因此我們構(gòu)建了含雙熒光報(bào)告基因的不同轉(zhuǎn)基因載體分別用于不同目的的轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)。<

2、br>　　 首先，為了探索團(tuán)頭魴β-actin啟動(dòng)子在家蠶BmN細(xì)胞和家蠶體內(nèi)的活性，將轉(zhuǎn)基因載體pigA3GFPAβdsRed和輔助質(zhì)粒混合，通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染BmN細(xì)胞和利用精子介導(dǎo)法導(dǎo)入家蠶受精卵，48 h后，可以觀察到同時(shí)發(fā)綠色熒光和紅色熒光的家蠶細(xì)胞，7天后，可觀察到蠶卵具有綠色熒光和紅色熒光，表明來(lái)自團(tuán)頭魴的β-actin啟動(dòng)子在家蠶BmN細(xì)胞中具有活性，隨著穩(wěn)定轉(zhuǎn)化細(xì)胞的傳代，綠色熒光穩(wěn)定存在，而紅色熒光會(huì)逐漸減弱直至檢

3、測(cè)不到，暗示β-actin啟動(dòng)子不能在家蠶中用于驅(qū)動(dòng)外源基因穩(wěn)定表達(dá)。
　　 然后，為探索來(lái)源于昆蟲(chóng)的piggyBac(PB)轉(zhuǎn)座子在鯉科魚(yú)轉(zhuǎn)基因中的適用性，在PB轉(zhuǎn)座子基礎(chǔ)上構(gòu)建了兩個(gè)轉(zhuǎn)基因載體：pigA3 GFP-CMVDsRed-IEneo與pigA3GFPAβDsRed，每個(gè)轉(zhuǎn)基因載體分別與輔助質(zhì)粒pigA3、pigCMV組合對(duì)草魚(yú)腎臟細(xì)胞CIK進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，都得到了同時(shí)具有綠色熒光和紅色熒光的CIK細(xì)胞，說(shuō)明啟動(dòng)子PAB

4、、PA3、Pcmv在CIK細(xì)胞具有啟動(dòng)活性。根據(jù)轉(zhuǎn)化細(xì)胞可穩(wěn)定傳代和PCR驗(yàn)證結(jié)果，認(rèn)證外源基因插入到細(xì)胞基因組，證明PB轉(zhuǎn)座子在CIK具有轉(zhuǎn)座活性。將輔助質(zhì)粒pigA3分別與轉(zhuǎn)基因載體vigA3GFP、pigA3GFPAβDsRed以脂質(zhì)體-精子介導(dǎo)法共同導(dǎo)入金魚(yú)卵細(xì)胞，根據(jù)綠色熒光和紅色熒光的共表達(dá)篩選轉(zhuǎn)基因金魚(yú)，再經(jīng)PCR、Southern雜交鑒定，表明得到了轉(zhuǎn)基因金魚(yú)，說(shuō)明PB轉(zhuǎn)座子在金魚(yú)體內(nèi)具有轉(zhuǎn)座活性。
　　 此外，

5、為了探索家蠶核型多角體病毒的多角體蛋白包埋特性，構(gòu)建了含有綠色熒光蛋白基因（gfp）和紅色熒光蛋白基因(dsRed)的表達(dá)載體plZT-DsRed。用該載體轉(zhuǎn)染家蠶卵巢細(xì)胞系BmN，并以吉?dú)W霉素(zeocin)篩選得到穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白和紅色熒光蛋白的細(xì)胞系，表明表達(dá)載體plZT-DsRed可以作為轉(zhuǎn)基因載體在BmN細(xì)胞使用；進(jìn)一步以野生型家蠶核型多角體病毒(BmNPV)感染該細(xì)胞系，熒光觀察發(fā)現(xiàn)部分多角體可以發(fā)出綠色熒光和紅色熒光，