含雙熒光報告基因的轉(zhuǎn)基因載體的應用.pdf

1、綠色熒光蛋白與紅色熒光蛋白自發(fā)現(xiàn)以來，就因易于檢測、熒光穩(wěn)定、無毒害、種屬通用性、易于構(gòu)建載體、可進行活細胞定位定時觀察等特性而得到廣泛應用。其應用領域涉及生命科學的各個領域，包括研究基因表達的調(diào)控元件、增強子捕獲、蛋白定位、研究基因表達的時空特性和空間定位、發(fā)育分子機理、篩選藥物、臨床檢驗、轉(zhuǎn)基因動物和植物的篩選標記以及對病毒顆粒定位、蛋白質(zhì)相互作用等方面。因此我們構(gòu)建了含雙熒光報告基因的不同轉(zhuǎn)基因載體分別用于不同目的的轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灐?

2、br>　　 首先，為了探索團頭魴β-actin啟動子在家蠶BmN細胞和家蠶體內(nèi)的活性，將轉(zhuǎn)基因載體pigA3GFPAβdsRed和輔助質(zhì)?；旌?，通過脂質(zhì)體介導轉(zhuǎn)染BmN細胞和利用精子介導法導入家蠶受精卵，48 h后，可以觀察到同時發(fā)綠色熒光和紅色熒光的家蠶細胞，7天后，可觀察到蠶卵具有綠色熒光和紅色熒光，表明來自團頭魴的β-actin啟動子在家蠶BmN細胞中具有活性，隨著穩(wěn)定轉(zhuǎn)化細胞的傳代，綠色熒光穩(wěn)定存在，而紅色熒光會逐漸減弱直至檢

3、測不到，暗示β-actin啟動子不能在家蠶中用于驅(qū)動外源基因穩(wěn)定表達。
　　 然后，為探索來源于昆蟲的piggyBac(PB)轉(zhuǎn)座子在鯉科魚轉(zhuǎn)基因中的適用性，在PB轉(zhuǎn)座子基礎上構(gòu)建了兩個轉(zhuǎn)基因載體：pigA3 GFP-CMVDsRed-IEneo與pigA3GFPAβDsRed，每個轉(zhuǎn)基因載體分別與輔助質(zhì)粒pigA3、pigCMV組合對草魚腎臟細胞CIK進行共轉(zhuǎn)染，都得到了同時具有綠色熒光和紅色熒光的CIK細胞，說明啟動子PAB

4、、PA3、Pcmv在CIK細胞具有啟動活性。根據(jù)轉(zhuǎn)化細胞可穩(wěn)定傳代和PCR驗證結(jié)果，認證外源基因插入到細胞基因組，證明PB轉(zhuǎn)座子在CIK具有轉(zhuǎn)座活性。將輔助質(zhì)粒pigA3分別與轉(zhuǎn)基因載體vigA3GFP、pigA3GFPAβDsRed以脂質(zhì)體-精子介導法共同導入金魚卵細胞，根據(jù)綠色熒光和紅色熒光的共表達篩選轉(zhuǎn)基因金魚，再經(jīng)PCR、Southern雜交鑒定，表明得到了轉(zhuǎn)基因金魚，說明PB轉(zhuǎn)座子在金魚體內(nèi)具有轉(zhuǎn)座活性。
　　 此外，

5、為了探索家蠶核型多角體病毒的多角體蛋白包埋特性，構(gòu)建了含有綠色熒光蛋白基因（gfp）和紅色熒光蛋白基因(dsRed)的表達載體plZT-DsRed。用該載體轉(zhuǎn)染家蠶卵巢細胞系BmN，并以吉歐霉素(zeocin)篩選得到穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白和紅色熒光蛋白的細胞系，表明表達載體plZT-DsRed可以作為轉(zhuǎn)基因載體在BmN細胞使用；進一步以野生型家蠶核型多角體病毒(BmNPV)感染該細胞系，熒光觀察發(fā)現(xiàn)部分多角體可以發(fā)出綠色熒光和紅色熒光，