CodY蛋白在嗜熱鏈球菌氮代謝調(diào)控中的作用研究.pdf

1、嗜熱鏈球菌作為酸奶發(fā)酵劑的一個關(guān)鍵組成部分，對酸奶質(zhì)地和風(fēng)味的形成具有重要作用。由于菌株的生長需要充足的碳源、氮源供應(yīng)，因此對菌株碳源氮源利用能力的調(diào)控成為改善菌株生長的一個重要手段，而對于嗜熱鏈球菌氮代謝的調(diào)控方面的研究報道較少，絕大多數(shù)數(shù)據(jù)是從乳酸乳球菌推斷而來的。CodY是存在于革蘭氏陽性細菌中的一種全局性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，可以對200多個基因的表達進行調(diào)控，這些基因一般在對數(shù)生長時期時受到阻遏，在營養(yǎng)物質(zhì)缺乏步入穩(wěn)定期之后又被誘導(dǎo)獲

2、得表達，進而幫助細胞來適應(yīng)營養(yǎng)僵乏的時期。根據(jù)已公布的嗜熱鏈球菌基因組信息(NC_006449和NC_008532等)推斷，發(fā)酵酸奶最廣泛使用發(fā)酵劑中的嗜熱鏈球菌中也應(yīng)含有一個類似的調(diào)控蛋白CodY，因此本研究主要通過構(gòu)建過量表達CodY蛋白的嗜熱鏈球菌突變株來分析該蛋白在嗜熱鏈球菌中的作用機制，試圖尋找CodY蛋白對嗜熱鏈球菌的氮代謝的影響。
　　 本課題根據(jù)對嗜熱鏈球菌KLDS3.0503的內(nèi)源質(zhì)粒進行分析，確認其可以作為宿

3、主細胞，提取DNA并設(shè)計相應(yīng)引物擴增出了codY基因。對pMEU5α載體的質(zhì)粒進行酶切驗證后與codY片段進行連接，成功構(gòu)建了CodY過表達重組質(zhì)粒，為了能夠更好的驗證CodY的作用，與此同時義構(gòu)建了載體自連質(zhì)粒，二者均成功電轉(zhuǎn)化入無質(zhì)粒菌株KLDS3.0503。利用已有的表達載體pNZCodY，經(jīng)Nisin誘導(dǎo)在乳酸乳球菌中表達出CodY蛋白，并使用HisTrap FF柱純化得到了重組蛋白His-CodY并鑒定該蛋白。通過SDS-PA

4、GE蛋白電泳、OD值的變化趨勢來驗證CodY對其蛋白表達及生長趨勢的影響。根據(jù)NCBI中公布的嗜熱鏈球菌的全基因組序列查找出與其氮代謝相關(guān)的十三個基因分別為prtM、amiD、ilvA、ilvCilvD1、gdhA、CodY、bcaT、argF、pepA、peps、pepN、pepC，通過RT-Real Time PCR對這十三個基因進行比較，說明CodY蛋白能夠控制這些基因的表達。
　　 本課題得出如下結(jié)論:
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5、.通過16S rRNA基因序列的測定鑒定了嗜熱鏈球菌KLDS3.0503，并通過質(zhì)粒分析確認其可以作為宿主細胞。
　　 2.成功從嗜熱鏈球菌KLDS3.0503中克隆出了codY基因片段。
　　 3.構(gòu)建的CodY過量表達載體及自連載體成功的在嗜熱鏈球菌KLDS3.0503中得到復(fù)制，并對二者生長趨勢進行OD值監(jiān)測，得出CodY蛋白可以調(diào)控原始菌株的生長趨勢。
　　 4.通過SDS-PAGE蛋白電泳明顯判斷出Co