蝰蛇（緬甸亞種）毒促凝—纖溶雙相活性組分FⅥbb的分離及生物活性研究.pdf

1、蝰蛇(緬甸亞種)屬于蝰亞科，是東南亞地區(qū)最常見(jiàn)的毒蛇種之一。蝰蛇毒主要表現(xiàn)為促凝活性，至今己從其中分離出多種促凝組分，如凝血因子X(jué)激活劑(RVV-X)、凝血因子V激活劑(RVV-V)等，而對(duì)其中纖維蛋白溶解組分的分離及性質(zhì)研究報(bào)道較少。其纖溶組分的多少、纖溶生物活性特征未完全明了。本課題針對(duì)蝰蛇(緬甸亞種)粗毒初分后表現(xiàn)纖溶活性的組分進(jìn)行了純化，卻發(fā)現(xiàn)分離終產(chǎn)物FⅥbb除可以直接溶解纖維蛋白原、纖維蛋白和酪蛋白外，還可以明顯縮短血漿凝固

2、時(shí)間，具有促凝活性。本實(shí)驗(yàn)即闡述了組分FVIbb的分離過(guò)程和部分生物活性特點(diǎn)。 一、組分FVIbb的分離純化 蝰蛇(緬甸亞種)毒組分FVIbb經(jīng)過(guò)三步分離程序得到。粗毒經(jīng)CM-SephadexC-50陽(yáng)離子交換層析得到12個(gè)蛋白峰，其中第2峰(FⅡ)和第6峰(FⅥ)具有較強(qiáng)的纖溶活性。FⅥ進(jìn)一步經(jīng)Sephadex G-150(超細(xì))凝膠過(guò)濾層析得到5個(gè)蛋白峰，其中第2峰即FVIb具有纖溶活性；將其再經(jīng)過(guò)Chelating

3、 Sepharose Fast Flow金屬離子螯合親和層析得到2個(gè)蛋白峰，其中第2峰(FVIbb)具有纖溶活性。最終回收率為4.24﹪。 FVIbb經(jīng)SDS-PAGE電泳顯示為單一條帶，經(jīng)質(zhì)譜測(cè)得分子量為59138，經(jīng)反相HPLC檢測(cè)組分FVIbb純度為94.98﹪。 二、FVIbb蛋白水解活力的測(cè)定 2．1 FVIbb的酪蛋白水解活性用水解Azo-Casein產(chǎn)生可溶于三氯乙酸的有色組分，使反應(yīng)液的A390值

4、升高的方法觀察FVIbb的酪蛋白水解活性。Azo-Casein是蛋白水解酶的發(fā)色底物。 結(jié)果：FVIbb可水解Azo-Casein，且隨著FVIbb濃度的升高，反應(yīng)液的A390值逐漸增大，顯示其蛋白水解活力逐漸增強(qiáng)。 2．2 FVIbb的纖維蛋白原溶解活性采用剩余可凝纖維蛋白原測(cè)定法，以FVIbb與纖維蛋白原共同溫育不同時(shí)間后，剩余的可凝纖維蛋白原含量減少的程度來(lái)表示其纖維蛋白原溶解活性。結(jié)果：溫育時(shí)間分別為1min、5

5、min、15min、30min和60min時(shí)，剩余可凝纖維蛋白原量(﹪)依次為74.4﹪、65.2﹪、47.8﹪、37.8﹪和18.1﹪。顯示隨著時(shí)間的延續(xù)，F(xiàn)VIbb水解掉的纖維蛋白原逐漸增多。 2．3 FVIbb的纖維蛋白溶解活性采用纖維蛋白平板法，將不同濃度的FVIbb 20ul點(diǎn)樣于纖維蛋白平板表面，以產(chǎn)生的透明溶解圈垂直兩直徑的乘積大小來(lái)表示纖溶活力。結(jié)果：FVlbb濃度分別為0.5mg/ml、1mg/ml、1.5mg

6、/ml、2mg/ml、2.5mg/ml和3mg/ml時(shí)，纖維蛋白溶解產(chǎn)生的透明溶解圈垂直兩直徑的乘積依次為18.46±1.93 mm<'2>、52.06±7.15mm<'2>、76.15±5.55mm<'2>、105.69±15.26 mm<'2>、124.82±4.9mm<'2>、151.81± 3.06 mm<'2>。顯示FVIbb能溶解纖維蛋白且在一定濃度范圍內(nèi)其纖溶活性具有量效關(guān)系。 2．4溫度、pH值、金屬離子和酶抑制

7、劑對(duì)FVIbb蛋白水解活性的影響在不同的溫度、pH值和金屬離子及抑制劑的環(huán)境中，F(xiàn)Ⅵbb水解Azo-Casein產(chǎn)生A390值的變化來(lái)考察環(huán)境對(duì)其活性的影響。結(jié)果顯示：FVIbb的最適溫度為40℃，最適pH為10.0；EDTA和DTT可顯著抑制其活性，PMSF和抑肽酶對(duì)其活性沒(méi)有影響；BE<'2+>、Ca<'2+>、Mg<'2+>可增強(qiáng)FⅥbb的蛋白水解活性，而Zn<'2+>、Ni<'2+>和Cu<'2+>可抑制其活性。表明FVIbb為

8、金屬蛋白酶，對(duì)熱不穩(wěn)定，在堿性條件下活性較好。 三、FVIbb降解纖維蛋白原及纖維蛋白活性的分析 3．1 FVlbb降解纖維蛋白原的作用 將0.5mg/ml的FVIbb加入纖維蛋白原溶液中溫育，在不同時(shí)間點(diǎn)取樣作SDS-PAGE。為考察。FVIbb降解纖維蛋白原的作用方式與人纖溶酶作用的異同，用同樣方法以0.5U/ml的人纖溶酶(Sigma)作對(duì)照。結(jié)果顯示：FVIbb對(duì)纖維蛋白原的Aα鏈、Bβ鏈和γ鏈均有水解作

9、用，但敏感性不同。Aα鏈1min后即消失，Bβ鏈30min后消失，γ鏈則需作用24h以上才緩慢消失。纖溶酶迅速降解纖維蛋白原，在15 min以內(nèi)纖維蛋白原的Aα鏈、Bβ鏈和γ鏈即完全降解。此外，F(xiàn)VIbb降解纖維蛋白原產(chǎn)生的水解片斷的大小與纖溶酶裂解纖維蛋白原產(chǎn)生的片斷大小不相同，說(shuō)明二者的作用位點(diǎn)不同。 3．2 FVlbb降解纖維蛋白的作用 將FVlbb與間接溶纖的尿激酶(UK)共同作用于普通平板和加熱平板，在加熱平板

10、中，殘留在纖維蛋白原中的纖溶酶原因加熱而失活，對(duì)照兩平板可判斷FVIbb溶解纖維蛋白的作用方式。結(jié)果：在普通平板上FVIbb和UK均可產(chǎn)生透明溶解圈；而在加熱平板上FVIbb可產(chǎn)生同樣大小的透明溶解圈，UK則不能溶解纖維蛋白。表明FVIbb不是通過(guò)激活纖溶酶原而發(fā)揮作用的，其溶纖作用是直接酶解纖維蛋白。 用凝血酶將纖維蛋白原變成纖維蛋白，再加入2 mg/ml的FVIbb共育，在不同時(shí)間點(diǎn)中止反應(yīng)，并取樣作SDS-PAGE。用同樣

11、方法以0.05U/ml的人纖溶酶(Sigma)0.15 ml作陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果顯示：FVIbb可水解纖維蛋白的α鏈、β鏈和γ-γ二聚體，但作用較人纖溶酶慢，共育8小時(shí)后才出現(xiàn)α鏈和γ-γ二聚體的少量水解，24小時(shí)后降解完全。FVIbb降解人纖維蛋白產(chǎn)生的片斷與人纖溶酶產(chǎn)生的纖維蛋白降解產(chǎn)物(FDP)不同。 四、FVIbb的促凝作用 以血漿復(fù)鈣時(shí)間(RT)的縮短來(lái)表示促凝活性。不同濃度的FVIbb與兔枸櫞酸鹽血漿混合，加入C

12、aCl<,2>后記錄抽出纖維蛋白細(xì)絲所需的時(shí)間即為血漿復(fù)鈣時(shí)間。用同樣方法比較FVIbb、蝰蛇粗毒和人凝血酶促凝活性的異同。結(jié)果：正常血漿復(fù)鈣時(shí)間為149.5±2.38s。FVIbb濃度分別為1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml和5mg/ml的血漿復(fù)鈣時(shí)間依次為8.5±1s、11±1.15 s、7±2s、8.5±1s、8.5±1s。粗毒濃度分別為1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml和5mg/ml的血漿

13、復(fù)鈣時(shí)間依次為9±1.15s、9.5±1s、16.5±1.9ls、18±2.3s、22.5±1.9ls。表明FVIbb和粗毒均具有促凝活性，但其促凝活性的大小不呈劑量依賴性。 五、FVIbb的類凝血酶活性測(cè)定 采用反應(yīng)板法測(cè)定FVIbb的類凝血酶活性。待測(cè)酶液與纖維蛋白原溶液混合，記錄抽出纖維蛋白細(xì)絲的時(shí)間。結(jié)果：2 mg/ml的FVIbb與纖維蛋白原混合不能形成纖維蛋白，且FVIbb與纖維蛋白原溶液混合10 min后再

14、加入凝血酶也無(wú)纖維蛋白形成。顯示FVIbb可溶解纖維蛋白原，沒(méi)有類凝血酶活性。 六、FVIbb的等電聚焦電泳 FVIbb的等電聚焦電泳結(jié)果顯示為兩個(gè)極接近的條帶，pI在4.8和4.9左右。表明FVIbb可能由兩種分子量相同、等電點(diǎn)不同但極接近的異構(gòu)體組成；也可能FVIbb是糖蛋白，由于糖基化修飾的不同形成多個(gè)等電點(diǎn)；亦或FVIbb純化不夠徹底。 小結(jié)： 1、蝰蛇(緬甸亞種)粗毒依次經(jīng)過(guò)CM-Sephade

15、x C-50陽(yáng)離子交換層析、SephadexG-150(超細(xì))凝膠過(guò)濾層析和Chelating Sepharose Fast Flow金屬離子螯合親和層析分離得到電泳純的組分FVIbb，純度)94.5﹪，分子量為59138。 2、組分FVIbb即可水解纖維蛋白原和纖維蛋白，又可水解酪蛋白。對(duì)纖維蛋白原的Aα鏈、Bβ鏈、γ鏈和纖維蛋白的α鏈、β鏈、γ-γ二聚體均有水解作用。 3、組分FVIbb可明顯縮短貧血小板血漿復(fù)鈣時(shí)間