廣西圓斑蝰蛇毒凝血因子X激活劑的分離純化及其止血作用的研究.pdf

1、凝血因子X激活劑可以在血管破損處激活因子X，促進(jìn)凝血酶生成，加速凝血過程，以達(dá)到迅速止血的目的，因而具有潛在利用價(jià)值，有可能開發(fā)為強(qiáng)效的止血藥。本文應(yīng)用層析方法從廣西圓斑蝰蛇毒中分離純化凝血因子X激活劑(factor Xactivator from Russel1's viper venom，RVV-VA)并觀察其部分活性影響因素和止血作用，旨在為進(jìn)一步研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)資料。
　　 1.RVV-VA的分離純化
　　 廣西圓斑

2、蝰蛇粗毒過HiPrep16/10 DEAE FF陰離子交換色譜，獲得6個(gè)蛋白質(zhì)組分。采用測定復(fù)鈣化時(shí)間，對各洗脫峰進(jìn)行活性測定，發(fā)現(xiàn)組分V的促凝活性具有鈣依賴性。該組分濃縮后經(jīng)Superdex G-75凝膠過濾色譜純化獲4個(gè)蛋白峰，其中第一峰具有凝血因子X激活活性。該組分經(jīng)10％SDS-PAGE，在非還原性條件下呈單一蛋白帶，分子量約為97.8kDa，還原性條件下呈一條重鏈(約76.3kDa)和一條輕鏈(約21.5kDa)，暫名為RVV

3、-VA。
　　 2.影響RVV-VA活性的因素
　　 在體外觀察不同條件下RVV-VA對家兔血漿活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)的影響，了解影響RVV-VA活性的因素。結(jié)果顯示，RVV-VA在pH6～9范圍內(nèi)活性最高，在溫度低于40℃時(shí)活性變化不大，溫度高于40℃時(shí)活性迅速下降。EDTA可完全抑制RVV-VA活性，L-半胱氨酸也可使RVV-VA活性顯著下降，但抑肽酶和苯甲基磺酰氟化物(PMSF)對其無影響。
　　

4、 3.RVV-VA對正常小鼠出血時(shí)間(BT)和凝血時(shí)間(CT)的影響
　　 小鼠尾靜脈注射RVV-VA0.313mU/kg～10mU/kg，用斷尾出血法和試管法測定小鼠BT和CT以選定實(shí)驗(yàn)的給藥劑量。結(jié)果顯示，在0.625mU/kg～10mU/kg劑量范圍內(nèi)，小鼠BT和CT均隨RVV-VA劑量增加而縮短(p＜0.05或p＜0.01)，其BT分別為3.53±0.25min、2.88±0.24min、2.95±0.20min、2.3

5、5±0.27min及2.58±0.26min，CT分別為2.45±0.26min、2.48±0.28mi n、1.78±0.25min、1.83±0.21min及1.55±0.20min，從中選擇0.625mU/kg、2.5mU/kg、10mU/kg作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的給藥劑量。
　　 4.RVV-VA對凝血功能障礙小鼠CT的影響
　　 采用肝素化和華法林化小鼠模型觀察靜脈注射RVV-VA對凝血功能障礙小鼠CT的影響。結(jié)果顯示

6、，肝素模型組小鼠CT由1.53±0.30min(對照組)延長至5.25±0.33min，華法林模型組小鼠CT由1.58±0.24min(對照組)延長至4.43±0.41min，表明造模成功。與相應(yīng)的模型組比較，RVV-VA10mU/kg和2.5mU/kg組小鼠CT分別為3.70±0.28min和4.88±0.27min，顯著縮短肝素化小鼠的CT(p＜0.01或p＜0.05)。RVV-VA10mU/kg、2.5mU/kg和0.625mU/

7、kg組小鼠CT分別為2.20±0.26min、3.23±0.32min和3.98±0.30min，顯著縮短華法林化小鼠的CT(p＜0.01或p＜0.05)，說明RVV-VA能一定程度減少肝素和華法林所致的出血傾向。
　　 5.RVV-VA對家兔全血凝固時(shí)間的影響
　　 觀察家兔靜脈注射RVV-VA后，CT在24h內(nèi)的變化情況，以了解RVV-VA的藥效及作用特點(diǎn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)家兔iv RVV-VA20mU/kg、5mU/kg或

8、1.25mU/kg10min后CT分別為2.75±0.35min、3.13±0.34min及3.46±0.49min，均比給藥前的4.08±0.30min、4.17±0.41min及4.21±0.37min顯著縮短(p＜0.01)。給藥30min后，藥效達(dá)高峰，其CT分別為2.33±0.26min、2.54±0.29min及2.88±0.41min。至給藥后12h，RVV-VA20mU/kg和5mU/kg組CT分別為3.38±0.28m

9、in和3.63±0.26min，仍比給藥前顯著縮短(p＜0.01或p＜0.05)，提示RVV-VA具有較長的促凝作用。
　　 6.RVV-VA對家兔肝臟創(chuàng)傷出血模型出血時(shí)間和出血量的影響
　　 采用家兔肝臟創(chuàng)傷出血模型，觀察靜脈注射RVV-VA前后家兔肝臟切口出血時(shí)間和出血量的變化情況。結(jié)果顯示，家兔iv RVV-VA20mU/kg、5mU/kg或1.25mU/kg后肝臟切口出血時(shí)間分別為1.19±0.05min、1.3

10、9±0.10min及1.58±0.20min，均比給藥前的2.15±0.25min、2.18±0.21min及2.24±0.21min顯著縮短(p＜0.01)；給藥后出血量分別為34.5±3.7mg、35.9±2.6mg及41.0±2.1mg，均比給藥前的77.0±7.8mg、79.0±2.0mg及71.4±2.4mg顯著減少(p＜0.01)，說明RVV-VA對破損的血管有明顯的止血作用。
　　 7.RVV-VA對家兔APTT、