蝰蛇（緬甸亞種）毒凝血因子X(jué)激活物FⅤe-1的分離純化、生化特征及生物活性研究.pdf

1、蝰亞科、蝮亞科和眼鏡蛇科等蛇毒中存在一類能作用于血液凝固酶促級(jí)聯(lián)反應(yīng)過(guò)程中的一個(gè)或多個(gè)環(huán)節(jié)的酶，即可激活FV、FVII、FIX、：FX、FII或直接使纖維蛋白原凝集(類凝血酶)的促凝組分。蝰科、響尾蛇科及眼鏡蛇科的蛇毒素中含有各種激活凝血因子X(jué)的組分。目前已經(jīng)有10余種的蛇毒FX激活組分被分離純化及定性，主要來(lái)自Cerastes cerastes、Vipera berus berus、Vipera lebetina、 Bungarus

2、fasciatus、King Cobra、Vipera russellii。圓斑蝰蛇(Vipera russellii)隸屬爬行綱(Reptilia)，有鱗目(Squamata)，蝰科(Viperidae)，蝰亞科(Viperinae)，蝰屬(ViperaLaurenti)，英文名稱為Russell'sviper。目前Esnouf和Williams、楊麗娟等以及孫環(huán)環(huán)等，均報(bào)道已從該種屬蛇毒中分離純化得到凝血因子X(jué)激活物。三者分離純化的

3、凝血因子X(jué)激活物均不同，其中Esnouf和Williams報(bào)道的RVV-X研究最為深入。然而，目前還沒(méi)有哪一個(gè)來(lái)自蝰亞科的FXa被開(kāi)發(fā)利用于臨床。蝰蛇各亞種資源豐富，開(kāi)發(fā)蝰蛇來(lái)源的止血制劑具有重要的意義。 目的： 本文選用了圓斑蝰蛇(緬甸亞種)的蛇毒干粉，從中分離純化出一個(gè)小分子量的凝血因子X(jué)(FX)激活物，并研究其理化性質(zhì)、凝血機(jī)制等方面內(nèi)容。 方法： 1．蝰蛇(緬甸亞種)蛇毒粗毒經(jīng)過(guò)CM-SephMe

4、x C-50陽(yáng)離子交換層析， Superdex<'TM >75凝膠層析及再次Superdex<'TM> 75凝膠層析純化分離得到蝰蛇(緬甸亞種)蛇毒FVe-1； 2．Tricine-SDS-PAGE鑒定其純度； 3．質(zhì)譜MALDI-TOF-TOF-MS測(cè)定分子量； 4．等電聚焦電泳測(cè)定等電點(diǎn)； 5．按Williams和Esnouf的方法研究FV e-1對(duì)兔貧血小板血漿的凝血作用； 6．特異性底物法

5、研究FV e-1對(duì)凝血因子X(jué)、凝血酶原的激活作用； 7．按Rong Gao和Manjunatha的方法研究FVe-l對(duì)纖維蛋白原作用； 8．按Astrup T.和Mullertz S．的纖維平板法研究FVe-1對(duì)纖維蛋白的作用； 9．特異性底物法測(cè)定不同溫度、不同pH、不同濃度鈣離子以及不同抑制劑對(duì)FVe-1酶活性影響； 10．FVe-1通過(guò)Tricine-SDS-PAGE轉(zhuǎn)至PVDF膜，采用Edman降

6、解法測(cè)定FVe-1的N端序列，再利用http：//www．ncbi．nlm．nih．gov/BLAST/Blast．cgi的系統(tǒng)進(jìn)行蛋白質(zhì)序列同源性比對(duì)。 結(jié)果： 1．蝰蛇蛇毒經(jīng)過(guò)CM-SephMex C-50陽(yáng)離子交換層、Superdex<'TM>75凝膠層析、再次Superdex<'TM> 75凝膠層析分離得到具有促凝作用的凝血組分(FVe-1)，為單鏈蛋白質(zhì)，其分子量為13808.171 Da，等電點(diǎn)為4.6；

7、 2．FVe-1可促使血漿凝固，呈量效、時(shí)效關(guān)系； 3．FVe-1可激活人凝血因子X(jué)，不能激活凝血酶原，不降解纖維蛋白原和纖維蛋白； 4．染色檢測(cè)顯示FVe-1中不含有糖基化成分； 5．FVe-1的適宜pH為6.5-7.5，適宜溫度為25-60℃，其酶活性為鈣依賴性； 6．EDTA和DTT都可以不同程度的抑制FVe-1的酶活性； 7．FVe-1的N端序列為NH<,2>N-L-V-Q-F-G-E

8、-M-I-N。 小結(jié)： 1．蝰蛇蛇毒經(jīng)過(guò)CM-Sephadex C-50陽(yáng)離子交換層、Superdex<'TM>75凝膠層析、再次Superdex<,TM> 75凝膠層析分離得到具有促凝作用的凝血組分(FVe-1)； 2．FVe-1可促使血漿凝固，呈量效、時(shí)效關(guān)系。該效應(yīng)是通過(guò)激活人凝血因子X(jué)產(chǎn)生的； 3．Fve-1為單鏈金屬蛋白酶，分子量13808.171 Da，等電點(diǎn)4.6；酶活性的適宜 pH為6-5