重組融合蛋白PFK-K5的發(fā)酵及純化研究.pdf

1、腫瘤細(xì)胞的惡性生長及轉(zhuǎn)移依賴于新生血管的形成，新生血管向腫瘤組織提供營養(yǎng)和氧氣并排出廢物[1]。腫瘤的血管依賴性觀點(diǎn)一經(jīng)提出，立即受到廣泛關(guān)注并迅即成為當(dāng)今腫瘤生物治療的研究熱點(diǎn)。我們實(shí)驗(yàn)室近年開展腫瘤血管生成抑制方面的研究，已分離克隆了多種內(nèi)源性血管生成抑制因子如：Endostatin(內(nèi)皮抑素)[2-3]、PF4(血小板因子4)、Angiostatin(血管抑素)的K1片段[4]、以及Plasminogen(人纖溶酶原)的K5片段[

2、5]等，并構(gòu)建和表達(dá)了PFK、PFK-K5、PFK-EN、PFK-VE等多種融合蛋白基因(未報(bào)道)。為滿足動物實(shí)驗(yàn)需要并為今后中試生產(chǎn)作準(zhǔn)備，我們開展了酵母表達(dá)系統(tǒng)的發(fā)酵研究。 甲醇畢赤酵母Pichiapastoris表達(dá)系統(tǒng)是繼釀酒酵母之后的第二代酵母表達(dá)系統(tǒng)，既具有原核表達(dá)系統(tǒng)操作簡單、表達(dá)高效、易于調(diào)控等特點(diǎn)，還具有真核細(xì)胞特有的蛋白質(zhì)修飾功能，在表達(dá)真核生物蛋白質(zhì)方面具有獨(dú)特優(yōu)越性[52]。該系統(tǒng)由便于控制的細(xì)胞營養(yǎng)生長

3、和外源蛋白表達(dá)二個(gè)階段組成，前一階段可實(shí)現(xiàn)高密度發(fā)酵，后一階段便于優(yōu)化表達(dá)條件。本文利用甲醇畢赤酵母工程菌P.pastorisGS115(pPICZαA-PFK-K5)表達(dá)重組融合蛋白PFK-K5，在搖瓶和發(fā)酵罐二個(gè)水平上分別探索發(fā)酵條件和表達(dá)條件，并對表達(dá)產(chǎn)物初步進(jìn)行分離純化工藝研究。 對搖瓶發(fā)酵及誘導(dǎo)表達(dá)條件如pH值，甲醇濃度，誘導(dǎo)時(shí)間和接種密度等參數(shù)進(jìn)行了研究，確定的表達(dá)條件為：恒定搖瓶轉(zhuǎn)速270r/min，最適pH6.0

4、，甲醇誘導(dǎo)濃度1.0％(v/v)。發(fā)酵及表達(dá)96小時(shí)后菌體密度OD600達(dá)5.0，PFK-K5表達(dá)量為97.17mg/L。搖瓶發(fā)酵結(jié)果為進(jìn)一步的發(fā)酵罐發(fā)酵研究提供了重要參考。 在12.8L發(fā)酵罐的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中，研究了菌體生長及誘導(dǎo)表達(dá)二個(gè)階段的工藝條件。發(fā)現(xiàn)在菌體生長階段添加組氨酸(0.1％)可提高菌體密度2.5倍(210g/L)，實(shí)現(xiàn)高密度發(fā)酵；在誘導(dǎo)表達(dá)階段繼續(xù)添加組氨酸(0.05％)最終可提高重組融合蛋白PFK-K5的表達(dá)3

5、倍(275.2μg/ml)。同時(shí)，通過研究發(fā)酵過程中溶解氧、菌體濕重、甘油/甲醇濃度及其補(bǔ)料方式與蛋白表達(dá)濃度之間的關(guān)系，獲得若干重要等發(fā)酵參數(shù)，初步建立重組融合蛋白PFK-K5的高密度發(fā)酵及誘導(dǎo)表達(dá)工藝條件。 初步探索重組融合蛋白PFK-K5的純化方法，利用硫酸銨鹽析和親和層析二種方法，特別是親和層析法，通過聯(lián)用批量法(Batch法)和柱層析法高度純化目的蛋白取得良好效果，PFK-K5純度達(dá)94.1％，但回收率僅22.0％，純