谷胱甘肽的過(guò)量合成及胞外積累研究.pdf

1、谷胱甘肽(Glutathione，GSH)是一種同時(shí)具有γ-谷氨?；蛶€基的生物活性三肽化合物，分為還原型和氧化型兩種，在生物體內(nèi)大量存在并起作用的是還原型谷胱甘肽。產(chǎn)朊假絲酵母（Candidautilis）屬于Crabtree陰性和Kluyver陽(yáng)性酵母，具有同時(shí)利用來(lái)源于生物質(zhì)中的己糖和戊糖的能力，且代謝阻遏效應(yīng)不明顯，因而成為合成GSH理想的細(xì)胞工廠。目前酵母發(fā)酵法被認(rèn)為是工業(yè)上生產(chǎn)GSH最具潛力的方法之一，而通過(guò)改變細(xì)胞生理狀態(tài)

2、提高GSH合成的研究才剛起步。本文通過(guò)采用酸脅迫和添加表面活性的手段或措施對(duì)酵母的生長(zhǎng)和代謝進(jìn)行調(diào)控，促使其過(guò)量合成目的產(chǎn)物并探討了作用機(jī)制。主要研究?jī)?nèi)容如下:
　　 (1)分析比較了恒定pH和不控制pH條件下GSH的分批發(fā)酵過(guò)程，確定pH3.5和pH1.5分別為弱酸脅迫和強(qiáng)酸脅迫條件。通過(guò)對(duì)C.utilisSZU07-01恒化培養(yǎng)過(guò)程進(jìn)行分析，選擇合適的酸脅迫時(shí)間分別為弱酸脅迫6h和強(qiáng)酸脅迫2h。采用分批補(bǔ)料培養(yǎng)方式，比較了不

3、同酸脅迫條件下的GSH生物合成情況，發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)時(shí)間弱酸脅迫比短時(shí)間強(qiáng)酸脅迫和不脅迫更利于GSH的過(guò)量合成。最后，分別從分批發(fā)酵動(dòng)力學(xué)、胞內(nèi)輔因子以及各關(guān)鍵代謝物的代謝通量變化規(guī)律等角度對(duì)弱酸脅迫促進(jìn)GSH過(guò)量合成的機(jī)理進(jìn)行了定量分析。
　　 (2)分析比較了恒定pH5.5條件下C.utilisSZU07-01和C.utilisΔgshl的GSH分批發(fā)酵過(guò)程，發(fā)現(xiàn)后者由于gshl基因拷貝數(shù)的減少，細(xì)胞合成GSH的能力下降，胞內(nèi)GSH的

4、含量比前者下降了50％。接著對(duì)培養(yǎng)至18h的兩菌株細(xì)胞分別實(shí)施了強(qiáng)酸脅迫和弱酸脅迫，發(fā)現(xiàn)弱酸脅迫對(duì)兩菌株細(xì)胞的生長(zhǎng)和GSH的合成沒(méi)有太大的影響，而在強(qiáng)酸脅迫下，細(xì)胞生長(zhǎng)受到一定抑制，GSH的總產(chǎn)量也比對(duì)照低，同時(shí)，強(qiáng)酸脅迫可以促進(jìn)GSH向胞外分泌，特別是在C.utilisΔgshl細(xì)胞中，胞外GSH的濃度比對(duì)照提高了208.9％。酸脅迫可以改變兩菌株的胞內(nèi)pH(pHi)，特別是在強(qiáng)酸脅迫下，pHi有明顯的下降，而C.utilisSZU0

5、7-01由于胞內(nèi)GSH濃度高于后者，能緩解這種下降趨勢(shì)，更有利于細(xì)胞保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。通過(guò)分析酸脅迫前后胞內(nèi)糖酵解關(guān)鍵酶活性的變化發(fā)現(xiàn)，強(qiáng)酸脅迫可導(dǎo)致己糖激酶(HK)、磷酸果糖激酶(PFK)、丙酮酸激酶(PK)活性大幅度的下降，而GSH濃度越高則越能緩解這種下降趨勢(shì)。酸脅迫可引起胞內(nèi)產(chǎn)生活性氧分子(ROS)，通過(guò)檢測(cè)兩菌株細(xì)胞內(nèi)SOD酶活性發(fā)現(xiàn)，在強(qiáng)酸脅迫下，由于C.utilisΔgshl胞內(nèi)GSH濃度較出發(fā)菌株少，SOD酶活性提高了18

6、0％，則在C.utilisSZU07-01細(xì)胞中只提高了69.5％，說(shuō)明GSH在清除ROS過(guò)程中也起著重要的作用。
　　 (3)考察了不同類型的表面活性劑對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、GSH合成及胞內(nèi)外分布的影響。聚氧乙烯(20)月桂醚(Brij35)和聚氧乙烯(20)單油酸酯(Tween80)由于極性上的差異對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和GSH合成的作用也不一樣。Brij35表現(xiàn)出對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，C.utilisSZU07-01、C.utilisΔgshl

7、和C.utilisΔgsh2三個(gè)菌株細(xì)胞的DCW最大分別下降了19.7％、5％、17.8％。Brij35也表現(xiàn)出對(duì)C.utilisSZU07-01和C.utilisΔgsh2的GSH合成能力的抑制作用，GSH總濃度分別下降了64.8％和37.72％;而B(niǎo)rij35則不會(huì)抑制C.utilisΔgshl的GSH合成能力;同時(shí)Brij35對(duì)三個(gè)菌株胞外GSH的積累不起作用。Tween80對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)幾乎沒(méi)有影響;同時(shí)，Tween80能促進(jìn)C.u

8、tilisSZU07-01胞外積累GSH，而C.utilisΔgshl和Δgsh2胞外的GSH濃度有輕微的下降。Tween80的添加對(duì)C.utilisSZU07-01的GSH合成能力有一定的抑制作用，但是GSH總濃度下降的幅度并不大。十二烷基硫酸鈉(SDS)和十六烷基溴化銨(CTAB)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)存在臨界濃度，在臨界濃度以下，不僅對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)存在抑制作用，而且也表現(xiàn)出對(duì)GSH合成的強(qiáng)烈抑制作用，但并不能促進(jìn)GSH向胞外分泌;在18h添加不同