飲酒對(duì)腦血管功能與結(jié)構(gòu)的影響及損傷機(jī)制.pdf

1、乙醇(ethanol，EtOH)又名酒精，是各種酒類飲品中主要的有效成分。本課題擬從飲酒后腦血管功能及結(jié)構(gòu)異常為切入點(diǎn)，從以下三個(gè)方面研究乙醇的血管毒性作用及機(jī)制:(1)建立慢性飲酒大鼠模型，觀察其腦血管功能及結(jié)構(gòu)變化;(2)觀察乙醇及代謝產(chǎn)物乙醛對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及血管平滑肌細(xì)胞的毒性作用;(3)探討氧化應(yīng)激機(jī)制在乙醇及其代謝產(chǎn)物乙醛對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及血管平滑肌細(xì)胞毒性中的作用。通過上述研究，探討飲酒后輕度外力打擊導(dǎo)致tSAH死亡的機(jī)制，為

2、此類案件法醫(yī)鑒定提供新的理論依據(jù)。
　　第一部分 飲酒對(duì)大鼠腦動(dòng)脈功能及結(jié)構(gòu)的影響
　　目的:
　　過量飲酒可導(dǎo)致腦血管灌注壓增加、腦血管擴(kuò)張和血管通透性增加，使腦血管自穩(wěn)態(tài)平衡破壞，并損害中樞神經(jīng)系統(tǒng)。本部分研究擬通過制備慢性飲酒動(dòng)物模型，觀察腦基底動(dòng)脈環(huán)舒縮功能及腦血管結(jié)構(gòu)的變化，從動(dòng)物整體水平明確飲酒對(duì)腦動(dòng)脈功能與結(jié)構(gòu)的影響，闡明飲酒的血管損傷靶點(diǎn)。
　　方法:
　　1.采用劑量遞增自由飲酒模式(20

3、％v/v酒-水溶液)持續(xù)飲酒12月，建立長期飲酒大鼠模型，并記錄大鼠一般情況及體重的變化;
　　2.采用HE染色、Masson三色染色法和硫堇染色分別觀察慢性飲酒大鼠腦血管和神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變;
　　3.采用微血管張力儀檢測長期飲酒大鼠腦基底動(dòng)脈環(huán)乙酰膽堿(ACh)誘導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性和硝普鈉(SNP)誘導(dǎo)的非內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)的變化，以及血管緊張素(AngⅡ)、內(nèi)皮素(ET-1)誘導(dǎo)收縮反應(yīng)的變化，明確飲酒對(duì)血管舒縮功能的影

4、響及其損傷靶點(diǎn);
　　4.采用放射性免疫分析方法，檢測長期飲酒大鼠血液中內(nèi)皮素和血管緊張素水平的變化;
　　5.采用DHE染色法檢測腦血管環(huán)活性氧，并采用免疫熒光染色及Western blot方法檢測氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白在腦血管環(huán)中的表達(dá)變化，以探討氧化應(yīng)激在飲酒造成腦動(dòng)脈功能與結(jié)構(gòu)改變中的作用。
　　結(jié)果:
　　1.慢性飲酒大鼠體重顯著降低，倦怠少動(dòng)，反應(yīng)遲鈍，毛發(fā)干澀;
　　2.慢性飲酒大鼠腦內(nèi)小動(dòng)脈及基底

5、動(dòng)脈血管管壁增粗，管腔變窄，壁/腔比明顯增大，膠原成分增多，并可見海馬神經(jīng)元發(fā)生變性、壞死。
　　3.慢性飲酒大鼠腦基底動(dòng)脈對(duì)ACh誘導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)下降，SNP誘導(dǎo)的非內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)無明顯變化;0.1μMAngⅡ誘導(dǎo)的收縮反應(yīng)性增強(qiáng)，而ET-1誘導(dǎo)的收縮反應(yīng)無明顯變化。
　　4.慢性飲酒大鼠血漿中腎素活性(PRA)和血管緊張素Ⅱ水平升高，內(nèi)皮素-1含量無明顯變化。
　　5.慢性飲酒大鼠腦基底動(dòng)脈環(huán)ROS及N

6、OX亞基p47 phox蛋白表達(dá)升高。
　　小結(jié):
　　本部分實(shí)驗(yàn)成功建立了慢性飲酒大鼠模型，并證實(shí)了長期大量飲酒可導(dǎo)致大鼠腦動(dòng)脈重構(gòu)，腦血管功能紊亂，并以內(nèi)皮依賴性舒張功能下降為著。長期飲酒后腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)激活，ROS水平表達(dá)升高，提示持久的氧化應(yīng)激造成內(nèi)皮細(xì)胞的損傷是長期飲酒導(dǎo)致腦血管穩(wěn)態(tài)失衡的重要因素之一。
　　第二部分 乙醇和乙醛對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的毒性作用及機(jī)制
　　目的:
　　采用人臍

7、靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilicalvein endothelial cell，HUVEC)，從細(xì)胞水平觀察乙醇和乙醛對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的毒性作用及細(xì)胞死亡機(jī)制，并探討氧化應(yīng)激在其致?lián)p傷過程中的作用。
　　方法:
　　1.給予HUVEC細(xì)胞不同濃度、不同時(shí)間的乙醇和乙醛刺激，采用MTT檢測HUVEC細(xì)胞生存率，觀察乙醇、乙醛對(duì)HUVEC的細(xì)胞毒作用;
　　2.采用流式細(xì)胞術(shù)檢測乙醇和乙醛處理后HUVCE細(xì)胞凋亡情況

8、，明確乙醇、乙醛誘導(dǎo)HUVCE細(xì)胞死亡的方式;
　　3.采用透射電鏡觀察乙醇和乙醛處理對(duì)HUVCE細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響;
　　4.采用共聚焦顯微鏡和Western blot方法觀察乙醇和乙醛對(duì)HUVEC細(xì)胞微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)表達(dá)的影響，明確乙醇和乙醛誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞死亡的自噬機(jī)制;
　　5.采用Western blot方法檢測乙醛對(duì)HUVEC細(xì)胞PI3K-AKT-mTOR和RAS-MEK-ERK通路中相關(guān)蛋

9、白的表達(dá)變化，并使用ERK抑制劑PD98059預(yù)處理細(xì)胞，以闡明乙醛誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞發(fā)生自噬的信號(hào)機(jī)制;
　　6.采用特異ROS探針標(biāo)記和熒光顯微鏡觀察乙醇和乙醛處理后氧化應(yīng)激產(chǎn)物的變化;并采用外源性過氧化氫(H2O2)和非特異性內(nèi)源性ROS清除劑N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine，NAC)預(yù)處理細(xì)胞，以明確乙醛是否可通過激活ROS-ERK通路誘導(dǎo)HUVCE細(xì)胞發(fā)生自噬。
　　結(jié)果:
　　

10、1.乙醇和乙醛均使HUVEC細(xì)胞生存率呈時(shí)間、劑量依賴性下降，并且乙醛的毒性作用比乙醇更快、更強(qiáng);
　　2.流式細(xì)胞術(shù)及透射電鏡結(jié)果顯示，乙醇(200mM)處理HUVEC細(xì)胞24h和48h，可見細(xì)胞發(fā)生早期凋亡，這些凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核形態(tài)不規(guī)則，核染色質(zhì)電子密度增高、邊集呈半月狀。乙醛(20μM)處理HUVEC細(xì)胞6h，細(xì)胞即發(fā)生非凋亡性細(xì)胞死亡。HUVEC細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)較多雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體;
　　3.乙醛處理HUVEC細(xì)胞

11、后，細(xì)胞骨架排列紊亂，胞體縮小，自噬標(biāo)記性蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值呈現(xiàn)時(shí)間及劑量依賴性升高，而給予不同劑量的乙醇處理HUVEC細(xì)胞不同時(shí)間后LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值無明顯變化;
　　4.乙醛處理HUVEC細(xì)胞后，磷酸化ERK呈現(xiàn)時(shí)間依賴性表達(dá)升高，而pAKT/AKT、pmTOR/mTOR表達(dá)均無明顯變化，給予ERK抑制劑PD98059預(yù)處理細(xì)胞后，可部分翻轉(zhuǎn)乙醛誘導(dǎo)的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高;
　　5.乙醇和乙

12、醛處理誘導(dǎo)的ROS增高呈現(xiàn)一過性，乙醇處理30min后ROS達(dá)頂峰，隨后逐漸下降;乙醛誘導(dǎo)的ROS增高出現(xiàn)更早、幅度更高、持續(xù)時(shí)間更長，20min時(shí)ROS達(dá)峰值，50min后仍高于對(duì)照組;
　　6.給予外源性H2O2處理HUVEC細(xì)胞，可使磷酸化ERK表達(dá)和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值顯著增加，給予非特異性內(nèi)源性ROS清除劑NAC則可部分逆轉(zhuǎn)乙醛誘導(dǎo)的磷酸化ERK水平和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高。
　　小結(jié):
　　過

13、量、持久的乙醇刺激可誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞發(fā)生凋亡;而乙醛則可以通過誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞產(chǎn)生大量的ROS，從而激活RAS-MEK-ERK通路快速誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞發(fā)生自噬，參與細(xì)胞損傷過程，而經(jīng)典的PI3K-AKT-mTOR通路在此過程中無明顯作用。
　　第三部分 過量乙醇對(duì)人腦血管平滑肌細(xì)胞的毒性作用機(jī)制
　　目的:
　　血管平滑肌細(xì)胞作為血管壁的主要細(xì)胞成分之一，在決定血管活性和血管結(jié)構(gòu)中具有重要意義。本部分研究采用人腦

14、血管平滑肌細(xì)胞(humanbrain vascular smooth cell，HBVSMC)，從細(xì)胞水平觀察乙醇對(duì)腦血管平滑肌細(xì)胞的毒性作用及其對(duì)細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的影響。
　　方法:
　　1.給予不同濃度的乙醇處理HBVSMC細(xì)胞，采用MTT法檢測HBVSMC細(xì)胞生存率，以觀察乙醇對(duì)HBVSMC的細(xì)胞毒作用;
　　2.利用流式細(xì)胞術(shù)和TUNEL法檢測乙醇處理后HBVSMC細(xì)胞凋亡情況，明確乙醇誘導(dǎo)HBVSMC細(xì)胞死亡的方

15、式;
　　3.觀察乙醇處理后HBVSMC細(xì)胞的形態(tài)變化，并用鬼筆環(huán)肽特異性標(biāo)記F-actin，Dnase標(biāo)記G-actin，通過共聚焦顯微鏡觀察不同時(shí)間、不同劑量乙醇對(duì)HBVSMC細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的影響;
　　4.提取細(xì)胞總蛋白，并分步提取HBVSMC細(xì)胞F-actin和G-actin蛋白，Weston blot方法觀察HBVSMC細(xì)胞F-actin/G-actin比值、細(xì)胞收縮表型相關(guān)蛋白SM22α、絲切蛋白Cofilin及細(xì)

16、胞縫隙連接蛋白Cx43表達(dá)的變化，進(jìn)一步明確乙醇對(duì)HBVSMC細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的影響;
　　5.采用特異ROS探針標(biāo)記和熒光顯微鏡觀察乙醇處理后HBVSMC細(xì)胞氧化應(yīng)激產(chǎn)物的變化。
　　結(jié)果:過量、持久乙醇作用可誘導(dǎo)HBVSMC細(xì)胞發(fā)生凋亡，并使Cx43和Cofilin表達(dá)異常，但是細(xì)胞骨架整體結(jié)構(gòu)未見明顯改變，且SM22α表達(dá)水平及F-actin/G-actin比值無明顯變化。另外，乙醇處理可能通過誘導(dǎo)HBVSMC細(xì)胞一過性R

17、OS的產(chǎn)生，繼而參與其凋亡過程。
　　結(jié)論:
　　1.長期大量飲酒可導(dǎo)致大鼠腦血管內(nèi)皮依賴性舒張功能下降，腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)激活，ROS水平升高。因此，持久的氧化應(yīng)激造成內(nèi)皮細(xì)胞的損傷可能是長期飲酒導(dǎo)致腦血管穩(wěn)態(tài)失衡的重要原因之一。
　　2.過量、持久的乙醇刺激可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生凋亡;而乙醛則可以通過誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生大量的ROS，激活ERK快速誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生自噬，參與細(xì)胞損傷過程。
　　3.過量乙