人NT-proBNP單克隆抗體的制備及其免疫傳感器的初步研究.pdf

1、研究業(yè)已證實(shí)，B型鈉尿肽(BNP)或其非活性的N末端前鈉尿肽(NT-proBNP)是心衰時(shí)較好的心臟標(biāo)志物[3]，能反映心室容積擴(kuò)大、心室超負(fù)荷和心臟功能有無損傷及損傷程度[4-7]。早在2000年"Heart"雜志在一篇名為“BNP：很快成為治療心衰患者的常規(guī)措施”的編者社論中就明確認(rèn)為腦鈉肽或B型鈉尿肽(brainnatriureticpeptide，B-typenatriureticpeptide；BNP)有助于診斷心衰，可作為心

2、衰患者預(yù)后標(biāo)志物，是一種新的監(jiān)控心衰的方法。2002年，國際上已經(jīng)公認(rèn)腦鈉肽前體，NT-proBNP，是測定心衰的一個(gè)劃時(shí)代的具有特異性的標(biāo)志物。2002年11月19日，F(xiàn)DA批準(zhǔn)羅氏診斷試劑公司(RocheDiagnostics，Inc)開發(fā)的一種用于實(shí)驗(yàn)室?guī)椭\斷充血性心力衰竭(congestiveheartfailure)新的ElecsysproBNP酶聯(lián)免疫檢測試劑盒上市。目前，國際上只有三家公司擁有此項(xiàng)技術(shù)，NT-proBNP

3、作為一種良好的心肌標(biāo)志物已經(jīng)獲得臨床認(rèn)可，正在逐步進(jìn)入臨床，國內(nèi)僅有少數(shù)幾個(gè)著名的三級甲等大醫(yī)院如北京醫(yī)院、解放軍總醫(yī)院開始使用進(jìn)口的NT-proBNP檢測試劑盒，但由于目前的相關(guān)檢測試劑依賴進(jìn)口，導(dǎo)致患者使用成本高。通過檢索，國內(nèi)尚未見到NT-proBNP檢測試劑相關(guān)專利及試劑盒產(chǎn)品注冊申報(bào)，因此，研發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的NT-proBNP新型免疫檢測方法，生產(chǎn)我國自己的NT-proBNP檢測試劑盒，改變目前高端臨床診斷試劑幾乎完全依賴

4、國外進(jìn)口產(chǎn)品的狀況，具有非常重要的社會效益和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。 主要的研究內(nèi)容和結(jié)果： 1.人NT-proBNP的高效原核表達(dá)及免疫學(xué)檢測標(biāo)準(zhǔn)品的研究 1.1NT-proBNP高效表達(dá)基因的構(gòu)建 我們采用人工合成和橋連拼接PCR技術(shù)相結(jié)合的方式構(gòu)建了能在大腸桿菌(E.coliBL21DE3)中高效表達(dá)的人NT-proBNP基因。根據(jù)GENEBANK提供的BNP基因序列(CR54976)得到NT-proBNP編碼序

5、列為pro-BNP基因中編碼第27-103個(gè)氨基酸的共228個(gè)堿基.將此序列遞交于Graphicalcodonusageanalyzer(http：//guca.schoedl.del)分析發(fā)現(xiàn)該基因中有部分氨基酸編碼的密碼子在E.coliBL21中使用的頻率較低。由于使用常規(guī)的逆轉(zhuǎn)錄PCR獲得的NT-proBNP基因無法避免以上問題，最終可能導(dǎo)致構(gòu)建的重組質(zhì)粒無法在大腸桿菌中順利表達(dá)。采用套疊PCR，根據(jù)其原理將改造的基因分成堿基數(shù)為

6、40左右的序列分別合成，每一片段與前后序列均有部分重疊，這樣片段間可以互為引物和模板最終得到全長基因，并實(shí)現(xiàn)了密碼子偏嗜性改造。 1.2人NT-proBNP的高效原核表達(dá)與純化 將進(jìn)行了密碼子偏嗜性改造后的NT-proBNP基因序列克隆入原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a和pET42a構(gòu)建不同形式的NT-proBNP原核表達(dá)重組質(zhì)粒；經(jīng)1.0mmol/L，IPTG37℃誘導(dǎo)表達(dá)5h，pET32a-NT-proBNP和pET42a-

7、NT-proBNP均在BL21中表達(dá)融合蛋白，分子量分別為30KD和40KD左右，表達(dá)量占菌體總蛋白的30％以上。經(jīng)鑒定表達(dá)蛋白破菌后主要在上清中，為可溶性表達(dá)。采用離子交換、HIS和GST親和層析柱建立了NT-proBNP重組蛋白的純化方法，所獲純化蛋白純度90％-95％左右。 1.3人NT-proBNP免疫學(xué)檢測標(biāo)準(zhǔn)品的制備。 對已獲得的NT-proBNP重組蛋白采用組合多種純化方案及EK(enterokinase；

8、腸激酶)酶切技術(shù)建立了NT-proBNP檢測標(biāo)準(zhǔn)品的純化工藝，用Roche公司NT-proBNP檢測試劑盒測定，與其它形式的NT-proBNP重組融合蛋白相比，NT-proBNP-83具有更好的免疫活性和穩(wěn)定性，組合多種純化方案及EK酶切技術(shù)，建立的純化工藝制備的NT-proBNP-83經(jīng)HPLC檢測純度達(dá)95％以上，適合用于NT-proBNP免疫學(xué)檢測工作標(biāo)準(zhǔn)品。 2.人NT-proBNP單克隆抗體的制備及鑒定 利用純

9、化的NT-proBNP蛋白免疫原采用改良的免疫程序和雜交瘤技術(shù)，經(jīng)歷14細(xì)胞融合，從數(shù)十株陽性克隆中篩選出7株抗NT-proBNP的特異性單克隆抗體，經(jīng)亞類鑒定其中有5株為適合應(yīng)用于診斷試劑的IgG1，經(jīng)免疫組化、ELISA、及Western等多種手段對所得特異性分析，結(jié)果顯示所制備的單抗為NT-proBNP特異的。 同時(shí)，采用表位在線分析及參考現(xiàn)有NT-proBNP免疫診斷試劑采用的表位，我們設(shè)計(jì)并合成了NT-proBNP分子

10、三個(gè)表位的多肽而且將其與KHL交聯(lián)。所合成多肽除了免疫動物制備相應(yīng)的表位抗體外，并且可用于對所獲抗體的表位初步鑒定，經(jīng)鑒定5株IgG單抗有兩株為相同表位抗NT-proBNP24-35氨基酸表位的抗體，其余三株正在鑒定，由此可見，結(jié)合后續(xù)多肽獲得的抗體，我們至少能制備出三個(gè)以上NT-proBNP表位的抗體，為NT-proBNP免疫診斷試劑的研發(fā)奠定最堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。 3.人NT-proBNP免疫傳感器檢測的初步研究 電化學(xué)免疫

11、傳感器由于其簡便、快速、靈敏度高等特點(diǎn)而具有良好的應(yīng)用前景。我們采用電沉積納米金技術(shù)將篩選的單克隆抗體固定于電極表面初步建立了基于電化學(xué)免疫傳感器，并用于人NT-proBNP的檢測。通過循環(huán)伏安法(CV)和交流阻抗技術(shù)(EIS)考察了電極表面的電化學(xué)特性，并對該免疫傳感器的性能進(jìn)行了詳細(xì)的研究。采用CV對人NT-proBNP進(jìn)行檢測，初步研究獲得了良好的檢測效果，基本建立了人NT-proBNP免疫傳感器，用此傳感器對臨床血清樣品的檢測顯