新城疫病毒單克隆抗體的制備及其免疫傳感器的初步研究.pdf

1、新城疫（Newcastle disease，ND），俗稱亞洲雞瘟，是禽類重大疫病之一，被國(guó)際獸醫(yī)局列為 A類傳染病，人感染新城疫主要是大量接觸病毒而引起結(jié)膜炎，防控新城疫在公共衛(wèi)生安全上有重要意義。目前診斷新城疫有諸多方法，但隨著NDV基因型的變異，現(xiàn)有的診斷方法已經(jīng)不能滿足需要，這就使得人們開始轉(zhuǎn)向開發(fā)新的檢測(cè)技術(shù)的研究。而光纖光柵生物傳感技術(shù)是目前光學(xué)生化痕量檢測(cè)的研究熱點(diǎn)，前期本實(shí)驗(yàn)室已成功將光纖光柵傳感器用于PCV2、NT-pr

2、oBNP的檢測(cè)。本研究基于極大角度傾斜光纖光柵的基本原理，選用金葡菌A蛋白（Staphylococcal protein A，SPA）為媒介將特異性的NDV單克隆抗體固定在Ex-TFG光柵表面，初步建立一種基于極大角度傾斜光纖光柵免疫傳感器，用于檢測(cè)NDV，以期為新城疫的臨床檢測(cè)提供新的方法。
　　本文的研究?jī)?nèi)容主要包括以下幾點(diǎn)：
　　1.對(duì)增殖的病毒提取RNA，通過(guò)RT-PCR法擴(kuò)增出NDV-F基因，克隆到pET32a(+

3、)載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化BL21（DE3）工程菌，并經(jīng)過(guò)對(duì)IPTG、溫度、時(shí)間等誘導(dǎo)條件的摸索，確定最優(yōu)誘導(dǎo)表達(dá)條件，利用His-tag鎳柱純化NDV-F重組蛋白，并對(duì)純化后的重組蛋白進(jìn)行鑒定。
　　2.以新城疫全病毒和F基因重組蛋白為抗原，免疫小鼠，采用PEG1500細(xì)胞融合技術(shù)制備單克隆抗體，并對(duì)其生物特性進(jìn)行鑒定；
　　3.分別經(jīng)羥基化、硅烷化、SPA敏感膜的制備、抗體固定等表面修飾初步構(gòu)建極大角度傾斜光纖光柵新城

4、疫病毒免疫傳感器，用于對(duì)NDV的檢測(cè)，并對(duì)其穩(wěn)定性、重復(fù)性、特異性進(jìn)行評(píng)價(jià)。
　　結(jié)果：
　　（1）誘導(dǎo)重組菌株表達(dá)，SDS-PAGE電泳檢測(cè)，在78kDa處出現(xiàn)了一條目的蛋白條帶，與預(yù)期相符合，且主要以包涵體的形式存在；經(jīng)過(guò)對(duì)誘導(dǎo)條件的優(yōu)化，確定在16℃、0.1mM IPTG，誘導(dǎo)20h時(shí)蛋白表達(dá)量最大；純化后的重組蛋白經(jīng)Western-Blot鑒定，進(jìn)一步證實(shí)了其主要在78kDa左右有明顯的蛋白印記條帶。
　　（2

5、）經(jīng)間接ELISA法篩選，全病毒組共獲得12株能穩(wěn)定分泌單抗的雜交瘤細(xì)胞株，F(xiàn)基因重組蛋白組獲3株陽(yáng)性細(xì)胞株。SDS-PAGE電泳分析獲得純度較高的單抗，純化后的單抗效價(jià)為1:64000，亞型主要為IgG型；Western-Blot顯示，全病毒免疫制備的單抗可能針對(duì)的是NDVF蛋白；而重組蛋白免疫組制備的單抗中，可以與病毒反應(yīng)，說(shuō)明制備的單抗可以識(shí)別F蛋白，顯示出良好的反應(yīng)原性。
　?。?）諧振波長(zhǎng)的變化顯示SPA和抗體能穩(wěn)定的結(jié)

6、合在Ex-TFG表面，設(shè)定新城疫病毒的濃度檢測(cè)范圍為0.05ng/mL-24ng/mL，對(duì)0-1ng/mL濃度范圍內(nèi)進(jìn)行擬合，知其在此范圍內(nèi)的靈敏度為342，有良好的線性度（R2=0.982），最高檢測(cè)極限為24ng/mL，最低檢測(cè)極限為0.2ng/mL；重復(fù)試驗(yàn)顯示，該傳感器具有較好的穩(wěn)定性，且能多次利用；特異性實(shí)驗(yàn)證明該制備的傳感器能特異性地識(shí)別新城疫病毒，而對(duì)禽流感病毒無(wú)反應(yīng)。
　　結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)初步建立了可檢測(cè)新城疫病毒的極