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文檔簡介
1、目的:
觀察1-103nmol/LProtein A純化抗鈉-鈣交換體(NCX)α-1(138-177)肽段抗體對離體大鼠心功能的影響;在使用抗原親和純化方法進(jìn)一步純化抗心肌Na+/Ca2+交換體α-1(138-177)抗體的基礎(chǔ)上,分別觀察其對大鼠心肌細(xì)胞Na+/Ca2+交換體、L-型鈣通道、內(nèi)向整流鐘通道和瞬時(shí)外向鉀通道電流的影響。
方法:
1.離體心臟灌流:用Protein A純化抗Na+
2、/Ca2+交換體α-1(138-177)抗體灌流正常大鼠離體心臟,利用Langendorff離體灌流系統(tǒng)觀察其對正常大鼠離體心功能的影響,觀測指標(biāo)包括左室發(fā)展壓(LVSP-LVDP)、左室最大上升速率(+dP/dtmax)和左室最大下降速率(-dP/dtmax)。同時(shí)觀察NCX特異性阻斷劑KB-R7943對大鼠心功能的作用。
2.抗體的抗原親和純化:利用抗原親和純化柱對多肽抗體進(jìn)行親和純化,并對純化后的抗體進(jìn)行ELISA檢
3、測,確定抗體效價(jià)。
3.膜片鉗全細(xì)胞記錄:應(yīng)用膜片鉗全細(xì)胞記錄模式觀察抗原親和純化后的抗心肌Na+/Ca2+交換體α-1(138-177)抗體對心肌細(xì)胞Na+/Ca2+交換電流、L-型鈣電流、內(nèi)向整流鉀電流和瞬時(shí)外向鉀電流的影響。
結(jié)果:
1.Protein A純化抗心肌Na+/Ca2+交換體α-1(138-177)抗體對正常大鼠離體心功能的影響:與對照組相比,1-10nmol/Lα-1抗體可使
4、正常大鼠離體心臟左室發(fā)展壓(LVSP-LVDP)和左室壓最大上升速率(+dP/dtmax)明顯增加(P<0.01)(表1,圖1.1,1.2,1.3,1.4),并使左室壓最大下降速率(-dP/dtmax)減小(P<0.01)(表1,圖1.1,1.2,1.3,1.4),且KB-R7943(2μmol/L)可使α-1抗體(1nmol/L)的上述效應(yīng)進(jìn)一步增強(qiáng)。然而,102-103nmol/Lα-1抗體則可使大鼠離體心臟LVSP-LVDP、±d
5、P/dtmax呈不同程度地下降(P<0.01)(表1,圖2.1,1.2,1.3,1.4)。
2.抗體效價(jià)、濃度及純化結(jié)果:問接ELISA法檢測結(jié)果顯示,經(jīng)抗原親和純化柱親和純化后,抗心肌Na+/Ca2+交換體α-1(138-177)抗血清效價(jià)為1∶32000,抗體濃度為0.5mg/ml(表2.1)。
3.抗原親和純化后抗心肌Na+/Ca2+交換體α-1(138-177)抗體對成年大鼠心室肌細(xì)胞Na+/Ca2+
6、交換電流及其他離子通道電流的影響:全細(xì)胞膜片鉗記錄結(jié)果表明,在0.1-102μg/mL濃度范圍內(nèi),抗α-1(138-177)抗體對大鼠心肌細(xì)胞外向及內(nèi)向Na+/Ca2+交換電流均呈現(xiàn)出劑量依賴性地抑制作用(表2.2,圖2.1)。對該抗體的進(jìn)一步研究表明,0.1-10μg/mL的該抗體對L-型鈣電流沒有作用,而102μg/mL的抗α-1抗體對L-型鈣電流也具有抑制作用(表2.3,圖2.2)。該抗體在0.1-102μg/mL濃度范圍內(nèi)對內(nèi)向
7、整流鉀電流和瞬時(shí)外向鉀電流均未見明顯作用(圖2.3、2.4)。
結(jié)論:
1.低濃度Protein A純化α-1(138-177)(1-10nmol/L)抗體可明顯增強(qiáng)心肌收縮,高濃度Protein A純化α-1(138-177)(102-103nmol/L)抗體對心肌的收縮和舒張均有抑制作用。
2.抗α-1(138-177)抗體經(jīng)抗原親和純化后,獲得了濃度和純度都較高的抗心肌Na+/Ca2+交換
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