瑞香素對CIA大鼠滑膜細胞促凋亡基因去甲基化作用及分子機制.pdf

1、目的:
　　探討瑞香素對CIA大鼠滑膜細胞促凋亡基因去甲基化作用及分子機制，進一步探索瑞香素治療RA的可能機制，為瑞香素的藥用開發(fā)和RA的治療思路提供理論與實驗依據。
　　方法:
　　1.培養(yǎng)CIA大鼠滑膜細胞;
　　2.MTT法檢測不同濃度瑞香素及5-aza-Dc對CIA大鼠滑膜細胞作用不同時間后對其增殖的影響;
　　3.瑞香素對CIA大鼠滑膜細胞促凋亡基因去甲基化作用及分子機制:實驗分組:①CIA大鼠滑

2、膜細胞未處理組（對照組）;②陽性去甲基化試劑5-aza-Dc（20μM）處理組(5-aza-Dc組);③瑞香素（40μg/mL）處理組（瑞香素組）;④瑞香素(40μg/mL)聯(lián)合5-aza-Dc(20μM)處理組（聯(lián)合組）。CIA大鼠滑膜細胞按上述實驗分組，經常規(guī)培養(yǎng)72h后收集細胞，檢測如下指標:(1)甲基化特異性PCR(methylationspecificPCR，MSP)檢測促凋亡基因DR3、PDCD5、FasL及p53甲基化狀態(tài)

3、;(2)實時熒光定量RT-PCR(real-timefluorescencequantitativePCR)檢測CIA大鼠滑膜細胞促凋亡基因DR3、PDCD5、FasL、p53及甲基化轉移酶DNMT1、DNMT3a、DNMT3bmRNA表達;(3)流式細胞術檢測促凋亡基因DR3、PDCD5、FasL及p53蛋白表達;(4)PI染色熒光顯微鏡觀察滑膜細胞凋亡情況;(5)AnnexinV/PI雙染流式法檢測滑膜細胞的凋亡率;(6)掃描和透射

4、電鏡法觀察CIA大鼠滑膜細胞超微結構的改變。
　　結果:
　　1.①瑞香素濃度（μg/mL）為40、20、10、5、2.5、1.25時，分別作用CIA大鼠關節(jié)滑膜細胞72h、60h、48h、36h后，抑制率(％)分別為:82.80±0.85、80.20±1.41、59.70±1.13、49.35±1.34;57.50±1.27、53.15±3.18、42.75±3.89、34.00±5.37;43.75±4.74、37.15

5、±4.45、35.05±3.32、29.55±1.63;40.50±3.82、35.90±5.09、33.90±4.95、28.70±0.34;37.40±4.53、34.25±5.73、27.85±1.48、23.15±3.18;33.25±3.46、26.50±1.98、25.65±0.42、19.50±1.13;②5-aza-Dc濃度(μM)為20、10、5、2.5、1.25時，分別作用于CIA大鼠滑膜細胞72h、60h、48h、

6、36h后，抑制率(％)分別為:84.30±1.56、82.90±3.39、72.10±1.84、32.35±2.62;57.35±4.31、46.15±3.89、34.15±3.18、25.75±4.17;53.65±1.20、45.40±3.68、23.65±0.70、20.25±0.07;49.30±1.27、39.90±1.27、17.35±1.48、13.65±1.20;30.95±2.19、24.41±2.68、13.23±0

7、.53、9.19±1.17。
　　2.MSP結果顯示CIA大鼠滑膜細胞對照組中促凋亡基因DR3、PDCD5、FasL及p53甲基化引物和非甲基化引物均擴增出特異性條帶。基因DR3、PDCD5、FasL和p53經瑞香素和5-aza-Dc處理后甲基化擴增條帶亮度均有所降低，相應的非甲基化擴增條帶亮度均有所增強。聯(lián)合組可見促凋亡基因DR3、FasL、PDCD5及p53甲基化擴增產物條帶較CIA大鼠滑膜細胞對照組和瑞香素、5-aza-Dc

8、單獨處理組亮度均降低，相應的非甲基化條帶亮度增強;其中PDCD5甲基化引物不能擴增出甲基化特異性條帶，而非甲基化引物可以擴增出特異性條帶，呈現完全非甲基化狀態(tài)。
　　3.RT-PCR結果顯示瑞香素組、5-aza-Dc組及聯(lián)合組DR3、PDCD5、FasL、p53mRNA表達水平明顯高于對照組(P＜0.05);瑞香素、5-aza-Dc組及聯(lián)合組甲基化轉移酶DNMT1、DNMT3a、DNMT3bmRNA表達水平明顯低于對照組（P＜0.

9、05）。瑞香素組中促凋亡基因中除FasL外，DR3、PDCD5和p53mRNA表達水平均明顯高于5-aza-Dc組;甲基化轉移酶中除DNMT1外，DNMT3a和DNMT3bmRNA表達水平均明顯低于5-aza-Dc組(P＜D.05)。聯(lián)合組中DR3、PDCD5、FasL和p53mRNA表達水平明顯高于瑞香素組和5-aza-Dc單獨處理組;甲基化轉移酶DNMT1、DNMT3a、DNMT3bmRNA達水平均顯著低于瑞香素組和5-aza-Dc

10、組（P＜0.05）。
　　4.流式細胞術結果顯示瑞香素、5-aza-Dc組和聯(lián)合組CIA大鼠滑膜細胞促凋亡蛋白DR3、PDCD5、FasL和p53陽性細胞百分率均顯著高于對照組(P＜0.05);瑞香素組除FasL外，DR3、PDCD5和p53陽性細胞百分率均顯著高于5-aza-Dc組（P＜0.05）;聯(lián)合組促凋亡蛋白DR3、PDCD5、FasL和p53陽性細胞百分率均顯著高于瑞香素組和5-aza-Dc組(P＜0.05)。
　

11、　5.PI染色后熒光顯微鏡下觀察到:CIA大鼠滑膜細胞對照組細胞呈極少量的強紅色熒光和微弱紅色熒光;5-aza-Dc組滑膜細胞微弱紅色和較強紅色熒光較對照組增加;瑞香素組滑膜細胞微弱和較強紅色熒光均較前兩組有所增加;聯(lián)合組滑膜細胞則大部分呈微弱和較強紅色熒光。
　　6.AnnexinV/PI雙染流式法顯示瑞香素組、5-aza-Dc和聯(lián)合組CIA大鼠滑膜細胞早期凋亡和晚期凋亡率均顯著高于CIA大鼠對照組(P＜0.05);聯(lián)合組滑膜細

12、胞凋亡率顯著高于瑞香素組和5-aza-Dc組(P＜0.05)。
　　7.掃描電鏡觀察對照組CIA大鼠滑膜細胞可見細胞呈圓形或橢圓形，表面有豐富細密的微絨毛狀突起;5-aza-Dc組可見細胞稍有形變，表面微絨毛減少;而瑞香素組較對照組變形嚴重，外觀呈不規(guī)則狀，細胞表面微絨毛狀突起消失，主要變現為小泡狀和指狀突起;聯(lián)合組滑膜細胞極度變形，細胞表面變得極為光滑，細胞表面局部已嚴重破裂。
　　8.透射電鏡顯示對照組CIA大鼠滑膜細胞

13、可見細胞表面絨毛、核膜結構清晰，核漿比大，核異型性明顯，核仁清晰，胞漿內細胞器發(fā)育良好;5-aza-Dc組表現為細胞體積縮小，形態(tài)不規(guī)則，表面微絨毛消失，雙層核膜清晰，核固縮，染色質邊聚，胞質內有少量粗面內質網、溶酶體，線粒體腫脹并發(fā)生空泡變性，游離核糖體發(fā)達，呈凋亡改變;瑞香素組較5-aza-Dc組染色質發(fā)生濃聚，凋亡進一步發(fā)展;聯(lián)合組滑膜細胞明顯可見核膜消失，凋亡小體形成。
　　結論:
　　本實驗屬于原創(chuàng)性研究，首次探討

14、了金邊瑞香活性成份瑞香素對CIA大鼠滑膜細胞促凋亡基因去甲基化作用及分子機制。
　　1.瑞香素在1.25μg/mL～40μg/mL范圍內對CIA大鼠滑膜細胞生長均有不同程度的抑制作用，且呈現良好的劑量依賴性。
　　2.瑞香素對CIA大鼠滑膜細胞促凋亡基因DR3、PDCD5、FasL及p53啟動子區(qū)具有一定的去甲基化作用。
　　3.瑞香素可協(xié)同5-aza-Dc使CIA大鼠滑膜細胞促凋亡基因DR3、PDCD5、FasL及p