去甲斑蝥素下調(diào)抑凋亡家族Bcl-2基因誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的分子機制研究.pdf

1、肝癌是常見的嚴(yán)重威脅著人們健康的惡性腫瘤。在我國,原發(fā)性肝癌是占第三位的和癌癥相關(guān)死亡因為?；颊呔驮\時多處于中晚期,失去了手術(shù)機會。迄今,化療是中晚期肝癌和其他惡性腫瘤的主要治療手段。但是,許多化療藥物在抗癌的同時,對正常細(xì)胞也有殺傷作用。一些天然藥物,特別是一些傳統(tǒng)的中草藥,和許多化療藥物相比,具有廣譜抗癌、低毒的優(yōu)點,有望成為治療惡性腫瘤的替代手段。許多研究顯示,許多中草藥含有抗癌的化學(xué)活性成分。因此,我們對傳統(tǒng)的中草藥是否存在對治

2、療原發(fā)性肝癌有生物活性成分進(jìn)行研究。
　　 斑蝥素是從斑蝥中提取出來的一種有效成分,作為一種傳統(tǒng)中草藥被長期應(yīng)用于疾病的治療中,對肝癌、乳腺癌、胃腸道和結(jié)直腸癌等有明顯的治療作用。但由于斑蝥素有嚴(yán)重的對胃腸道和尿道粘膜的嚴(yán)重的毒副作用,導(dǎo)致其應(yīng)用受到嚴(yán)重的限制。因此,很多人工合成的斑蝥素衍生物應(yīng)運而生。去甲斑蝥素(Norcantharidin,NCTD)是斑蝥素去甲基后的衍生物,在顯示強烈地抗腫瘤特性外,對于正常細(xì)胞具有低毒性的

3、特點。NCTD對胃腸道和尿道粘膜很小的毒性作用和骨髓抑制。早期的研究證明,NCTD的抗腫瘤特點包括抑制細(xì)胞增殖、阻滯細(xì)胞有絲分裂于G2/M期、通過caspase途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而不影響單核血細(xì)胞活性。在NCTD處理后,促凋亡和抑凋亡Bcl-2家族蛋白比例增加和細(xì)胞凋亡同時被觀察到。這種促/抑凋亡蛋白的比例水平作為細(xì)胞凋亡的“開關(guān)”作用被長期地認(rèn)識到。
　　 凋亡是程序性的細(xì)胞死亡,包括了一系列生化過程和細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征的改變并最終

4、導(dǎo)致細(xì)胞死亡。典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)變化包括細(xì)胞發(fā)泡、細(xì)胞膜的改變?nèi)缒さ牟粚ΨQ和粘附性的丟失,核碎裂、細(xì)胞體皺縮、染色質(zhì)濃縮、染色體DNA斷裂。在多細(xì)胞生物體,包括人類和大部分動物多種疾病的發(fā)生和凋亡存在缺陷有關(guān)。凋亡缺失或不足可導(dǎo)致細(xì)胞擴增不受控制,并導(dǎo)致如癌癥的發(fā)生。先前的研究顯示凋亡是化療藥物從事它們的毒性作用和抗腫瘤作用主要機制。此外,近期的研究也顯示凋亡能提高腫瘤對化療藥物的敏感性和化療效果。
　　 目的:
　　

5、 先前的研究顯示,NCTD能誘導(dǎo)體外人結(jié)腸癌、口腔癌、惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞等的凋亡。但是,NCTD誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞的凋亡機制很少被涉及。因此,在這個實驗中,我們對NCTD誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞株SMMC-7721、BEL-7402細(xì)胞的凋亡機制進(jìn)行探討。
　　 方法：
　　 對肝癌細(xì)胞株SMMC-7721,BEL-7402進(jìn)行體外培養(yǎng),應(yīng)用NCTD處理肝癌細(xì)胞,采用MTT方法測定肝癌細(xì)胞的增殖率,臺盼藍(lán)拒染法檢測肝癌細(xì)胞的死亡率,Anne

6、xin V/PI雙染,流式細(xì)胞儀測定肝癌細(xì)胞的凋亡率,蛋白質(zhì)印跡(Western blot)檢測半胱氨酸天門冬氨酸蛋白酶(caspase)和聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)蛋白,以及肝癌細(xì)胞的Bcl-2抑凋亡家族基因的表達(dá)。實驗數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析,用(x)±s表示,采用單因素方差分析,用Dunnettt檢驗進(jìn)行組間比較,以α=0.05作為顯著性檢驗水準(zhǔn)。
　　 結(jié)果：
　　 MTT檢測顯示NCTD

7、處理24,48和72 h后SMMC-7721細(xì)胞IC50分別為12,6和1.6μg/ml,BEL-7402細(xì)胞IC50分別為10,4和2μg/ml；臺盼藍(lán)拒染法結(jié)果顯示,濃度為3μg/ml、10μg/ml、30μg/ml的NCTD處理24 h后,SMMC-7721細(xì)胞的死細(xì)胞率分別為16.89％、46.16％、72.13％,均顯著高于未處理對照組的死細(xì)胞率3.34％(P<0.01)；BEL-7402細(xì)胞的死細(xì)胞率分別為19.59％、50

8、.10％、90.31％,均顯著高于未處理對照組的死細(xì)胞率2.88％(P<0.01)。流式細(xì)胞儀檢測顯示,NCTD10μg/ml處理16 h,SMMC-7721細(xì)胞凋亡率達(dá)到45.25％,較未處理對照組(18.86％)升高26.39％,BEL-7402細(xì)胞凋亡率達(dá)到41.51％,較未處理對照組(22.29％)升高19.22％；Western blot結(jié)果顯示,NCTD10μg/ml處理8、14和24 h后,在兩株肝癌細(xì)胞均檢測到caspa