siRNA沉默KDR基因?qū)θ巳榘┘?xì)胞甲基化和凋亡作用的研究.pdf

1、背景與目的：腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移與腫瘤血管生成(Angiogenesis)密切相關(guān)。血管內(nèi)皮生長因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)及其受體在腫瘤血管形成中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用[1-4]，能刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂、增殖，誘導(dǎo)血管生成，有助于腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。己發(fā)現(xiàn)的VEGFR有三種：VEGFR1(FLT-1)、VEGFR2(FLK-1、KDR)和FLT-4，VEGFR2在VEGF相關(guān)的病理性血管

2、形成中發(fā)揮了重要作用[5]。阻斷KDR表達(dá)是一種較好的抗腫瘤治療策略[6]。因此，本課題采用化學(xué)修飾的siRNA在體外敲減KDR基因，探討KDR的表達(dá)抑制對乳癌細(xì)胞抑癌基因甲基化狀態(tài)和凋亡的誘導(dǎo)作用及其機制，為其應(yīng)用于臨床提供理論和實驗依據(jù)。
　　 方法：體外化學(xué)合成針對KDR基因的siRNA序列，在脂質(zhì)體Lipofectamine2000TM介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞，行Hoechst33258染色，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡的形

3、態(tài)學(xué)改變；采用RT-PCR檢測caspase-3、survivin、NES1及RUNX3表達(dá)水平；甲基化特異性PCR(methylation specificPCR，MSP)技術(shù)檢測NES1和RUNX3基因的甲基化情況；比色法檢測caspase-3的活性；利用免疫組織化學(xué)方法檢測survivin的表達(dá)，并用圖象分析儀分析蛋白表達(dá)強度。
　　 結(jié)果：靶向KDR的siRNA轉(zhuǎn)染MCF-7后誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，caspase-3的表達(dá)和活性