pAdtrack-cmv-rHSG重組穿梭質(zhì)粒載體的構(gòu)建、序列分析及rHSG生物信息分析.pdf_第1頁(yè)
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1、目的:(1)在前期構(gòu)建pExpress-1-Rhsg重組質(zhì)粒載體基礎(chǔ)上,構(gòu)建大鼠增殖抑制基因(rat hyperplasia suppressor gene,Rhsg)pAdtrack-cmv-Rhsg重組穿梭質(zhì)粒并鑒定,為進(jìn)一步構(gòu)建腺病毒載體及腦血管痙攣的基因治療提供物質(zhì)基礎(chǔ)。
   (2)對(duì)測(cè)序報(bào)告結(jié)果中Rhsg基因序列進(jìn)行序列與結(jié)構(gòu)相關(guān)的生物信息分析,為認(rèn)識(shí)該基因結(jié)構(gòu)與功能提供借鑒。
   方法:
   (

2、1)目的基因的提?。簭?fù)蘇本室保存的含pExpress-1-Rhsg質(zhì)粒的Jm109菌,用質(zhì)粒抽取試劑盒抽取質(zhì)粒pExpress-1-Rhsg,并在PCR儀中擴(kuò)增出目的基因Rhsg Cdna。
   (2)穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定:①?gòu)?fù)蘇本室保存的含腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdtrack-cmv的DH5α菌種,用質(zhì)粒抽取試劑盒抽取質(zhì)粒pAdtrack-cmv;②將PCR后Rhsg Cdna連接到Pgm-T質(zhì)粒上,構(gòu)建重組質(zhì)粒Pgm-T-Rhs

3、g,并對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切鑒定;③將Pgm-T-Rhsg重組質(zhì)粒在LB固體瓊脂培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α,提取Pgm-T-Rhsg質(zhì)粒;④用BglⅡ、Eco RV對(duì)Pgm-T-Rhsg重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切,提取目的基因并鑒定;⑤用BglⅡ和Eco RV雙酶切pAdtrack-cmv質(zhì)粒得到線性化的pAdTrack-CMV 片斷,在T4DNA連接酶下與目的基因連接,構(gòu)建出重組pAdtrack-cmv-Rhsg穿梭質(zhì)粒,并對(duì)重組

4、穿梭質(zhì)粒pAdtrack-cmv-Rhsg進(jìn)行酶切鑒定;⑥將重組穿梭質(zhì)粒送測(cè)序公司進(jìn)行DNA序列分析。
   (3)Rhsg基因生物信息分析:根據(jù)測(cè)序報(bào)告結(jié)果中Rhsg基因序列,用生物信息學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行同源性、分子量、蛋白跨膜區(qū)、等電點(diǎn)、親疏水性、蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)等項(xiàng)的分析和預(yù)測(cè)。
   結(jié)果:
   (1)從質(zhì)粒pExpress-1-Rhsg中成功提取出了Rhsg Cdna基因。
   (2)重組pAdtr

5、ack-cmv-Rhsg穿梭質(zhì)粒經(jīng)BglⅡ和Eco RV雙酶切后,進(jìn)一步將重組體進(jìn)行基因測(cè)序分析,驗(yàn)證了克隆的Rhsg Cdna序列與GenBank[AF036536]公布的Rhsg序列吻合。這一結(jié)果表明重組體pAdtrack-cmv-Rhsg中插入的目的基因是正向、單倍插入。
   (3)Rhsg生物信息分析結(jié)果顯示,Rhsg全長(zhǎng)4151bp,編碼一757氨基酸殘基的蛋白,可能為一跨膜蛋白,經(jīng)基因Genebank查詢發(fā)現(xiàn)與人H

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