草酰腙縮乙醛酸三環(huán)己基錫酯誘導(dǎo)大細(xì)胞肺癌H460細(xì)胞凋亡及其機(jī)制研究.pdf

1、研究背景和研究目的： 據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，肺癌是當(dāng)今世界上最大的癌患，其死亡率居于各種惡性腫瘤之首位，中國(guó)也已成為世界上第一肺癌大國(guó)。按組織學(xué)類型可將肺癌分為兩大類：小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌。非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）占肺癌的85％以上。由于非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移后禁忌手術(shù)，且對(duì)放療很不敏感，因此，對(duì)非小細(xì)胞肺癌化療藥物的開(kāi)發(fā)與研究尤為重要。 肺癌化療的常用藥物有如下五類：直接破壞DNA藥物、插入DNA模板藥物、影響核酸合成藥物、抑

2、制微管裝配藥物、影響蛋白質(zhì)合成藥物五類。盡管上述藥物可有效誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡，但是毒副作用較大且容易引起耐藥，從而導(dǎo)致化療失敗。因此，開(kāi)發(fā)毒性小、副作用少、能克服多藥耐藥和有效啟動(dòng)肺癌細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)途徑的藥物是目前亟待解決的問(wèn)題。 本研究選用H460、A549、H1792、H226、WI38細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞研究有機(jī)錫小分子化合物抑制NSCLC細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制，原因在于：1）此四種NSCLC細(xì)胞分別來(lái)源于腺癌、大細(xì)胞癌、鱗癌，涵蓋了非

3、小細(xì)胞肺癌的三種亞型；2）此四種NSCLC細(xì)胞均可單獨(dú)作為非小細(xì)胞肺癌研究領(lǐng)域里的模式細(xì)胞，用于細(xì)胞水平的檢測(cè)；3）迄今對(duì)有機(jī)錫小分子化合物誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究還比較少；4）WI38細(xì)胞是從人胚肺組織建立的二倍體成纖維細(xì)胞系，作為正常細(xì)胞經(jīng)常被用作肺癌研究的對(duì)照細(xì)胞。因此可用以上細(xì)胞系篩選小分子化合物，并對(duì)其機(jī)制做深入研究，為NSCLC化療藥物的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。 化學(xué)遺傳學(xué)（chemical genetics）是利

4、用化學(xué)工具來(lái)研究生物體系的一種新興手段，其可以在以下兩個(gè)重要方面促進(jìn)新藥開(kāi)發(fā)：一方面是鑒定出在某種疾病形成過(guò)程中起重要作用的基因或蛋白質(zhì)，從而為新藥篩選提供靶點(diǎn)；另外一方面是發(fā)現(xiàn)特異性作用于某個(gè)基因或蛋白質(zhì)的小分子化合物，從而為新藥開(kāi)發(fā)提供先導(dǎo)化合物?；瘜W(xué)遺傳學(xué)應(yīng)用的關(guān)鍵之一是要有大量的可供篩選的不同結(jié)構(gòu)的化合物，新興的組合化學(xué)很好地解決了這一難題，在同一個(gè)化學(xué)反應(yīng)體系中加入不同結(jié)構(gòu)單元，利用這些結(jié)構(gòu)單元的排列組合，就能夠系統(tǒng)地合成大量

5、化合物。近年來(lái)，化學(xué)遺傳學(xué)在細(xì)胞凋亡研究領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用：美國(guó)哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院袁鈞瑛教授帶領(lǐng)課題組進(jìn)行了“用小分子研究細(xì)胞死亡過(guò)程中的信號(hào)傳導(dǎo)：從Bcl-2到程序性壞死”的研究；美國(guó)密執(zhí)安大學(xué)癌癥中心王少萌教授開(kāi)展了“合理設(shè)計(jì)小分子拮抗劑來(lái)調(diào)控關(guān)鍵性細(xì)胞壞死和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間的相互作用”的研究；另外，美國(guó)國(guó)立癌癥研究所（NCI）早在1997年啟動(dòng)了一項(xiàng)新計(jì)劃，將化學(xué)遺傳學(xué)應(yīng)用到癌癥治療研究中，即利用細(xì)胞滲透性的小分子化合物觸發(fā)腫瘤細(xì)胞

6、死亡。這充分說(shuō)明化學(xué)遺傳學(xué)方法為細(xì)胞凋亡研究提供了一個(gè)可靠的平臺(tái)，基于此平臺(tái)，利用具有一定生物活性的小分子化合物作為研究手段來(lái)研究細(xì)胞凋亡過(guò)程中的信號(hào)傳導(dǎo)，優(yōu)勢(shì)明顯：小分子化合物易于進(jìn)入細(xì)胞，易于引起細(xì)胞表型變化，其作用具有劑量依賴性，適用于多蛋白家族，不會(huì)引起細(xì)胞的適應(yīng)性變化等，另外，這些小分子化合物還往往可以作為“先導(dǎo)化合物”，進(jìn)而指導(dǎo)新藥的開(kāi)發(fā)研究。 近幾年來(lái)，本課題組一直在從事有機(jī)小分子化合物庫(kù)的構(gòu)建工作，目前，庫(kù)中已包

7、含了60余種有機(jī)錫小分子化合物。研究顯示，某些有機(jī)錫化合物具有抗腫瘤活性，這已經(jīng)在MCF-7（乳腺癌）、WiDr（結(jié)腸癌）、P388（小鼠白血?。┑瓤拱┗钚匝芯恐械玫阶C實(shí)。這些研究大都停留在生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)階段，部分研究顯示有機(jī)錫化合物可以阻滯腫瘤細(xì)胞周期，但對(duì)其抑制生長(zhǎng)、誘導(dǎo)凋亡的分子機(jī)制仍然不清楚。因此，探討有機(jī)錫小分子化合誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡分子機(jī)制具有重要意義。 基于以上考量，本課題研究目的是：利用化學(xué)遺傳學(xué)這一新興技術(shù)平臺(tái)，以

8、非小細(xì)胞肺癌H460、A549、H1792和H226細(xì)胞為研究對(duì)象，對(duì)草酰腙縮乙醛酸三環(huán)己基錫酯（OGTCT）的體外抗腫瘤活性進(jìn)行研究，進(jìn)而探討其誘導(dǎo)H460細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，為新型肺癌化療藥物的開(kāi)發(fā)提供更加完善的理論依據(jù)。 研究?jī)?nèi)容： 1.鑒定OGTCT對(duì)NSCLC細(xì)胞、耐藥細(xì)胞H460/TaxR及人胚肺二倍體成纖維細(xì)胞WB8的生長(zhǎng)抑制作用。 2.探討OGTCT對(duì)H460細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用。 3.分析

9、OGTCT對(duì)H460細(xì)胞周期分布及周期調(diào)控相關(guān)蛋白p53、p21、PCNA表達(dá)的影響。 4.分析OGTCT誘導(dǎo)H460細(xì)胞凋亡過(guò)程中，凋亡相關(guān)調(diào)控因子的變化及重要凋亡通路的激活情況。 研究方法： 1細(xì)胞生長(zhǎng)抑制檢測(cè)： 1.1 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率，由此對(duì)OGTCT進(jìn)行初步篩選： 1.2選擇目前臨床上常用抗腫瘤藥物紫杉醇（Paclitaxel）為對(duì)照藥物，用MTT法檢測(cè)其對(duì)腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞的生

10、長(zhǎng)抑制情況，并與OGTCT做比較。 2.細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法： 2.1倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化及凋亡小體； 2.2 Hoechst33258熒光染色，并結(jié)合熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核形態(tài)變化； 2.3乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒檢測(cè)細(xì)胞是否出現(xiàn)壞死； 2.4臺(tái)盼藍(lán)拒染法進(jìn)一步檢測(cè)細(xì)胞是否出現(xiàn)壞死； 2.5用Nucleosome ELISA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。 3.細(xì)胞周期及其相關(guān)調(diào)控

11、蛋白表達(dá)變化的檢測(cè)： 3.1流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)OGTCT對(duì)細(xì)胞周期分布的影響； 3.2酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定技術(shù)（ELISA）檢測(cè)與細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)重要蛋白p53和p21的表達(dá)變化； 3.3免疫熒光結(jié)合激光掃描共聚焦顯微鏡檢測(cè)增殖細(xì)胞核抗原PCNA的表達(dá)及分布； 3.4 Western blot檢測(cè)p53蛋白的表達(dá)。 4.熒光探針結(jié)合激光掃描共聚焦技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞中鈣離子濃度變化。 5.檢測(cè)OGTCT

12、對(duì)ICE家族蛋白酶成員激活情況，方法如下： 5.1用ApoAlert caspase-3，-8比色檢測(cè)試劑盒分析caspase-3，-8酶活性變化； 5.2用ApoAlert caspase9/6熒光檢測(cè)試劑盒分析caspase-9/6酶活性變化； 5.3用caspase抑制劑檢測(cè)caspase-3，8，6，9對(duì)OGTCT誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響。 6.免疫熒光結(jié)合激光掃描共聚焦顯微鏡檢測(cè)抗凋亡蛋白Bcl-

13、2的分布及表達(dá)。 7.Western blot檢測(cè)細(xì)胞色素C（Cyto-C）的表達(dá)變化。 8.酶聯(lián)免疫（ELISA）試劑盒檢測(cè)Fas/FasL的表達(dá)變化。 研究結(jié)果： 1.OGTCT抗腫瘤活性檢測(cè)結(jié)果（MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率）。 2.OGTCT誘導(dǎo)H460細(xì)胞凋亡的研究結(jié)果。 2.1倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化。 3.OGTCT對(duì)H460細(xì)胞周期的影響及相關(guān)分子機(jī)制研究結(jié)果。

14、 4.OGTCT誘導(dǎo)H460細(xì)胞凋亡的相關(guān)分子機(jī)制研究結(jié)果。 結(jié)論： 1.OGTCT以濃度依賴的方式，顯著降低NSCLC和H460/TaxR細(xì)胞的存活率。OGTCT與紫杉醇相比優(yōu)勢(shì)明顯：對(duì)正常細(xì)胞WI38的毒性極小，且能有效克服腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥性。 2.OGTCT能有效誘導(dǎo)H460細(xì)胞凋亡。OGTCT可能通過(guò)上調(diào)p53和p21蛋白水平、降低PCNA表達(dá)的方式將細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期、下調(diào)Bcl-2蛋白表