加味生脈飲含藥血清對非小細(xì)胞肺癌H460細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響.pdf

1、肺癌在20世紀(jì)末已成為各種癌癥死亡的首要原因，目前發(fā)病率仍呈上升趨勢。腫瘤轉(zhuǎn)移是腫瘤發(fā)生和演變過程中最危險的階段，臨床上，60％以上的肺癌患者在發(fā)現(xiàn)腫瘤時已經(jīng)轉(zhuǎn)移，因此，加強肺癌及其轉(zhuǎn)移的研究勢在必行。本論文主要分為理論探討和體外細(xì)胞實驗兩部分，理論部分分別從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和中醫(yī)學(xué)對惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的相關(guān)機制研究進展進行綜述，并以中醫(yī)絡(luò)病學(xué)理論為指導(dǎo)，深入論述了惡性腫瘤及其轉(zhuǎn)移的病機證治。認(rèn)為惡性腫瘤形成及轉(zhuǎn)移的主要病機演變過程是:病邪由氣絡(luò)至血

2、絡(luò)，導(dǎo)致痰瘀互結(jié)、癌毒凝聚而形成腫瘤;若腫瘤之伏毒進一步被激發(fā)，則可造成轉(zhuǎn)移瘤發(fā)生，依次傳變，由輕而重。因而提出將絡(luò)病思維引入惡性腫瘤及轉(zhuǎn)移的治療中。同時，全面闡述了益氣養(yǎng)陰通絡(luò)解毒法及其選方加味生脈飲的立法選方依據(jù)。體外細(xì)胞實驗部分主要研究加味生脈飲含藥血清對肺癌H460細(xì)胞增殖、周期、遷移、粘附的影響，以及對上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的干預(yù)作用及其分子機制。
　　目的:應(yīng)用血清藥理學(xué)方法，研究加味生脈飲含藥血清對非小細(xì)胞肺癌H460細(xì)胞增殖

3、、周期、遷移、粘附的影響，并檢測上皮型標(biāo)志物E-cad及間質(zhì)型標(biāo)志物Vimentin、N-cad蛋白及分子表達(dá)的變化，探討加味生脈飲是否可以抑制H460細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，進而抑制非小細(xì)胞肺癌的轉(zhuǎn)移。
　　方法:給予家兔灌胃濃縮至一定生藥含量的加味生脈飲，采血制備含藥血清及空白血清，過濾，分裝備用，實驗分為10％、5％、2.5％含藥血清組和10％空白血清組。體外培養(yǎng)H460細(xì)胞，采用MTT法測定不同含藥血清對H460細(xì)胞增殖的影

4、響;采用流式細(xì)胞儀測定不同含藥血清對H460細(xì)胞周期的影響;采用劃痕實驗初步觀察含藥血清對H460細(xì)胞遷移的影響;采用Transwell技術(shù)觀察含藥血清對非小細(xì)胞肺癌遷移的影響（實驗中發(fā)現(xiàn)H460細(xì)胞無法通過8mmTranswell膜，故改用非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞替代H460細(xì)胞）;采用Matrigel鋪膠模擬體內(nèi)基底膜，觀察含藥血清對H460細(xì)胞粘附的影響;檢測含藥血清作用H460細(xì)胞后細(xì)胞E-cad及Vimentin蛋白含量的變化

5、;采用RT-PCR法檢測含藥血清作用H460細(xì)胞后細(xì)胞Vimentin、N-cad表達(dá)的變化。
　　結(jié)果:1.加味生脈飲含藥血清對H460細(xì)胞在24h范圍內(nèi)有一定抑制增殖作用，與空白血清組比較均存在顯著性差異(P＜0.01)，5％、10％含藥血清組略優(yōu)于陽性對照順鉑組，但48h時各組含藥血清幾乎無抑制細(xì)胞增殖作用。
　　2.流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果表明，不同濃度含藥血清作用H460細(xì)胞24h后，和空白血清相比，各組含藥血清S期細(xì)胞

6、百分率均有增高，且存在一定的濃度-效應(yīng)關(guān)系，10％含藥血清S期比例高達(dá)61.1％，48h后含藥血清組細(xì)胞主要集中在G0-G1期，而DDP繼續(xù)集中在S期，S期細(xì)胞61.6％。
　　3.劃痕實驗示，不同濃度含藥血清處理H460細(xì)胞24h和48h后，含藥血清劃痕距離較空白血清組增加，呈現(xiàn)濃度和時間相關(guān)性，以上初步說明加味生脈飲對H460細(xì)胞具有抑制遷移的作用。
　　4.Transwell實驗研究表明，隨著含藥血清濃度的增高，遷移到

7、膜下表面的A549細(xì)胞數(shù)降低，和空白血清對照組比較有顯著性差異(P＜0.01)，5％含藥血清和10％含藥血清組遷移率僅為25.64％和13.31％。
　　5.粘附實驗發(fā)現(xiàn)，加味生脈飲藥物血清作用H460細(xì)胞24h和48h后，與空白血清對照組比較，含藥血清組細(xì)胞粘附率降低，與對照組有顯著性差異(P＜0.01)，24h粘附率分別為93.51％、90.15％、82.47％(2.5％、5％、10％含藥血清)，48h粘附率分別為76.23％

8、、68.33％、53.33％，血清濃度越高，粘附率越低，且48h較24h粘附率降低。
　　6.Western blot實驗發(fā)現(xiàn)，隨著含藥血清濃度的升高，E-cad蛋白含量升高，Vimentin蛋白含量降低，與空白血清對照相比均有顯著性差異(P＜0.01)，且呈現(xiàn)濃度相關(guān)性，10％含藥血清E-cad含量最高、Vimentin含量最低。
　　7.RT-PCR實驗結(jié)果示，作用時間一定時，隨著含藥血清濃度增加，Vimentin和N-

9、cad這兩種間質(zhì)型分子的基因表達(dá)量呈下降趨勢，與空白血清對照相比，除48h2.5％含藥血清組有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，其余含藥血清組均有顯著性差異(P＜0.01);血清濃度相同時，隨著作用時間的延長，Vimentin和N-cad的表達(dá)亦逐漸下降;間質(zhì)型標(biāo)志物Vimentin和N-cad的表達(dá)與含藥血清濃度和作用時間負(fù)相關(guān)。
　　結(jié)論:1.加味生脈飲對H460細(xì)胞增殖有一定的抑制作用，結(jié)合流式術(shù)檢測結(jié)果，其對H460細(xì)胞24h的