LPS誘導(dǎo)人結(jié)腸上皮細(xì)胞(NCM460)凋亡機(jī)制研究.pdf

1、腸粘膜屏障是腸道內(nèi)的第一道防線，是可以將腸道細(xì)菌與外界隔開(kāi)的動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)，能夠調(diào)節(jié)營(yíng)養(yǎng)吸收以及粘膜免疫平衡。上皮細(xì)胞的異常凋亡、緊密連接的結(jié)構(gòu)與功能遭到破壞均可以造成腸粘膜屏障損傷。脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的一種強(qiáng)促炎分子，腸腔內(nèi)細(xì)菌異常繁殖，LPS產(chǎn)生積累過(guò)多，導(dǎo)致粘膜屏障受損，有毒物質(zhì)釋放到血液中，會(huì)引起全身性炎癥反應(yīng)。LPS造成粘膜屏障損傷與上皮細(xì)胞凋亡和緊密連接蛋白功能異常有關(guān)，

2、但具體分子機(jī)制尚不明確。
　　本研究選擇人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460為模型，探討LPS對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡的影響及分子機(jī)制，以期為探明LPS致粘膜損傷的機(jī)制提供新的佐證。
　　首先我們利用MTT法、Hoechest33342染色、流式細(xì)胞術(shù)（AnnexinⅤ-PI雙染法）、熒光分光光度計(jì)法以及Western-blot等方法研究LPS是否誘導(dǎo)人結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460增殖或凋亡以及對(duì)緊密連接蛋白ZO-1和Occludin表達(dá)的影

3、響，結(jié)果發(fā)現(xiàn):(1) LPS能夠顯著抑制NCM460細(xì)胞增殖且具有濃度依賴性;(2) LPS能夠誘導(dǎo)NCM460細(xì)胞發(fā)生凋亡，有濃度和時(shí)間依賴特點(diǎn)，細(xì)胞凋亡水平隨LPS濃度提高或處理時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)上升趨勢(shì);(3) LPS能夠抑制緊密連接蛋白ZO-1和Occludin的表達(dá)，抑制作用隨LPS濃度提高明顯加強(qiáng)。這些結(jié)果表明LPS可以抑制人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460增殖，誘導(dǎo)其凋亡，并且顯著抑制緊密連接蛋白的表達(dá)，預(yù)示著LPS造成粘膜屏障損傷

4、可能是通過(guò)誘導(dǎo)上皮細(xì)胞凋亡并抑制緊密連接蛋白的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。
　　其次，本研究探討LPS誘導(dǎo)結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460發(fā)生凋亡的機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn):(1) LPS刺激NCM460細(xì)胞分泌TNF-α，與對(duì)照組相比，TNF-α基因轉(zhuǎn)錄水平明顯升高(p＜0.01)，細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α的含量也明顯升高(p＜0.05);(2) LPS刺激可以導(dǎo)致細(xì)胞高表達(dá)死亡受體TNFR1、死亡接頭蛋白FADD;(3)LPS刺激NCM460細(xì)胞后Caspa

5、se8的活性明顯上升(p＜0.01)，而Caspase9的活性與對(duì)照相比卻沒(méi)有顯著性變化(p＞0.05);(4) Caspase8抑制劑Z-LETD-FMK顯著抑制LPS誘導(dǎo)的NCM460細(xì)胞凋亡(p＜0.05)以及TNFR1和FADD的高表達(dá);(4) LPS刺激NCM460細(xì)胞后，MyD88的表達(dá)水平升高，而TIRAP的表達(dá)卻不受LPS刺激的影響;(5) LPS處理細(xì)胞，膜受體TLR4封閉組與未封閉組相比，TNFR1、MyD88、FA

6、DD的表達(dá)水平均有明顯下降，Caspase3和Caspase8的活性也明顯降低(p＜0.05);(6) TNF-α處理NCM460細(xì)胞，通過(guò)膜受體TNFR1促進(jìn)FADD的表達(dá)。從以上結(jié)果我們得出下列結(jié)論:(1)LPS通過(guò)死亡受體途徑誘導(dǎo)NCM460細(xì)胞發(fā)生凋亡;(2) NCM460細(xì)胞通過(guò)膜受體TLR4識(shí)別LPS，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是MyD88依賴型的，構(gòu)成LPS/TLR4/MyD88信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路;(3) LPS通過(guò)MyD88依賴通路誘導(dǎo)NC

7、M460細(xì)胞分泌TNF-α。TNF-α通過(guò)其受體TNFR1（死亡受體）調(diào)節(jié)FADD表達(dá)，激活死亡受體途徑，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。
　　最后，本研究探討了mTORC1信號(hào)通路和轉(zhuǎn)錄因子STAT1、NF-κB對(duì)LPS誘導(dǎo)NCM460細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn):(1) LPS刺激NCM460細(xì)胞能夠激活mTORC1與轉(zhuǎn)錄因子STAT1以及NF-κB，且STAT1與NF-κB p65的磷酸化受mTORC1調(diào)節(jié);(2) Rapamycin減弱LP

8、S誘導(dǎo)的MyD88、FADD蛋白合成以及FLIP基因轉(zhuǎn)錄;(3)Rapamycin抑制LPS誘導(dǎo)的NCM460細(xì)胞凋亡、TNF-α的分泌以及Caspase3和Caspase8的活性。從以上結(jié)果我們推測(cè)mTORC1可能通過(guò)激活與凋亡相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子STAT1以及NF-κB來(lái)調(diào)節(jié)LPS誘導(dǎo)的NCM460細(xì)胞凋亡，更具體的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。
　　綜上所述，LPS可以誘導(dǎo)人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460凋亡，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路為MyD88依

9、賴型。細(xì)胞通過(guò)膜表面受體TLR4識(shí)別LPS，繼而通過(guò)MyD88信號(hào)接頭蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)，構(gòu)成LPS/TLR4/MyD88信號(hào)通路，介導(dǎo)LPS信號(hào)調(diào)控細(xì)胞分泌炎癥因子TNF-α; TNF-α可以通過(guò)死亡受體TNFR1促進(jìn)FADD蛋白高表達(dá)，從而激活Caspase8/Caspase3相關(guān)凋亡通路，引發(fā)細(xì)胞凋亡;mTORC1信號(hào)通路對(duì)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB以及STAT1活性具有調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而調(diào)控凋亡相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄與蛋白表達(dá)，實(shí)現(xiàn)對(duì)LPS誘導(dǎo)NCM460