青藤堿對肺癌細(xì)胞系NCI-H460增殖、凋亡的影響及其機(jī)制的研究.pdf

1、前言
　　 肺癌是嚴(yán)重威脅人類生命的疾病,最新統(tǒng)計(jì)資料顯示,在世界范圍內(nèi),肺癌所引起的死亡占所有腫瘤引起的死亡的首位。盡管目前多種治療方法,包括分子靶向治療,但肺癌治療的效果始終不令人滿意,其五年生存率低于15％。為了提高其5年生存率,更多的治療方法正在被探索之中。目前中醫(yī)藥方法治療肺癌受到了日益的關(guān)注。
　　 青藤堿(sinomenine,SIN)是抗風(fēng)濕中藥青風(fēng)藤(Sinomeninum scutum Rehd.et

2、Wils.)的單體提取物,其分子式為C19H23NO4,分子量329.38。青藤在中國應(yīng)用于治療風(fēng)濕病已經(jīng)有上千年歷史。其目前在應(yīng)用上主要以其鹽酸鹽形式為主即鹽酸青藤堿為主。青藤堿具有抗炎、抗風(fēng)濕、免疫抑制、鎮(zhèn)痛、抗血管生成、抗心律失常等廣泛的藥理作用。新近研究報(bào)導(dǎo)其具有一定的抗腫瘤作用。
　　 細(xì)胞凋亡,又稱程序性死亡,包括一系列生物化學(xué)事件,引起細(xì)胞發(fā)生特征性形體變化和生物化學(xué)改變。一些藥物通過誘導(dǎo)凋亡的方式抑制惡性腫瘤的增

3、殖。細(xì)胞凋亡主要有三種通路:一種是以Fas和TNFR為代表死亡受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,凋亡發(fā)生過程中伴有caspase-8的活化；第二種是以線粒體為核心的凋亡途徑,Cytochrome c從線粒體釋放到胞漿與APaf-1繼而與Caspase-9結(jié)合,引起Caspase-9自身剪切激活,啟動(dòng)凋亡過程中伴有caspase-9的活化；第三種是以內(nèi)質(zhì)網(wǎng)為核心的凋亡途徑,凋亡過程中伴有caspase-12的活化。目前青藤堿對肺癌細(xì)胞是否有抑制作用的研究

4、尚未見報(bào)導(dǎo)。
　　 本實(shí)驗(yàn)研究青藤堿對非小細(xì)胞肺腺癌細(xì)胞系NCIH-460增殖和凋亡的影響,并研究其機(jī)制,為深入研究青藤堿抗腫瘤機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),應(yīng)用于臨床治療肺癌提供理論依據(jù)。
　　 實(shí)驗(yàn)材料與方法
　　 一、青藤堿對肺癌細(xì)胞系NCI-H460增殖、凋亡的影響的研究
　　 采用四甲基偶氮噻藍(lán)(MTT)法檢測青藤堿對NCI-H460細(xì)胞增殖的；采用流式細(xì)胞儀AnnexinⅤ/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡；TdT

5、酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記(TUNNEL)方法觀察細(xì)胞的形態(tài)變化;采用掃描電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化。
　　 二、青藤堿誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞系NCI-H460凋亡的機(jī)制的研究
　　 采用羅丹明123(Rhodamine123)染色,通過流式細(xì)胞儀檢測線粒體膜電位(△Ψm)；采用分光光度法檢測caspase-3、caspase-8和caspase-9的活性的變化；采用Western blot方法檢測SIN對凋亡相關(guān)的蛋白如細(xì)胞色

6、素C、Bcl-2、Bax的表達(dá)的影響。
　　 三、MEK/ERK和PI3K/Akt信號通路參與青藤堿誘導(dǎo)NCI-H460細(xì)胞凋亡的研究
　　 采用Western blot法檢測SIN對NCI-H460細(xì)胞的ERK1/2、p-ERK1/2、Akt、p-Akt的表達(dá)的影響；采用流式細(xì)胞儀PI單染的方法檢測信號通路阻滯劑與青藤堿聯(lián)合對NCI-H460細(xì)胞凋亡的影響。
　　 結(jié)果
　　 一、青藤堿對肺癌細(xì)胞系NC

7、I-H460增殖、凋亡的影響:
　　 隨著SIN濃度的加大和作用時(shí)間的延長,其對細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用,呈現(xiàn)明顯的時(shí)間-劑量效應(yīng)關(guān)系。SIN 240μg/ml作用72 h,其抑制率達(dá)到最大的85.89％。流式細(xì)胞AnnexinⅤ/PI檢測細(xì)胞凋亡分析表明,SIN作用48 h,隨濃度的增高,早期凋亡和晚期凋亡細(xì)胞的比例都逐漸增加,與對照組相比差異具有顯著性(P<0.05)。SIN 200μg/ml組可見凋亡細(xì)胞細(xì)胞核的棕黃色著

8、色,并可見細(xì)胞內(nèi)DNA呈片段化的改變,而對照組沒有相應(yīng)的變化。通過透射電鏡觀察,對照組NCI-H460的細(xì)胞形態(tài)規(guī)整,細(xì)胞核較大,線粒體豐富,膜相結(jié)構(gòu)完整；青藤堿組凋亡細(xì)胞體積變小,胞質(zhì)濃縮,胞漿內(nèi)空泡增多,染色質(zhì)固縮、邊集或碎裂成不規(guī)則塊狀,線粒體腫脹。
　　 二、青藤堿誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞系NCI-H460凋亡的機(jī)制:
　　 120μg/ml,200μg/ml SIN處理24 h后,結(jié)果表明caspase-3和caspase

9、-9被活化,從而參與細(xì)胞凋亡的發(fā)生。120,200μg/ml SIN處理48 h后,處理的細(xì)胞內(nèi)的△Ψm峰值下降,分布在去極化區(qū)域的細(xì)胞增多,與對照組比較有顯著差異(P<0.05),細(xì)胞內(nèi)的△Ψm峰出現(xiàn)有意義的向左移的趨勢。SIN(80,120,160,200μg/ml)對NCI-H460細(xì)胞作用48 h后,結(jié)果可見細(xì)胞漿內(nèi)細(xì)胞色素C逐漸增多,而線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C逐漸減少,細(xì)胞色素C由胞漿釋放到線粒體中。經(jīng)過SIN(80,120,160

10、,200μg/ml)處理NCI-H460細(xì)胞48 h后,Western blot方法檢測結(jié)果顯示,隨SIN濃度的不斷增加,Bax蛋白表達(dá)水平逐漸升高,而Bcl-2蛋白表達(dá)水平隨濃度的增加逐漸降低,Bax/Bcl-2的比值逐漸升高。
　　 三、MEK/ERK和PI3K/Akt信號通路參與青藤堿誘導(dǎo)NCI-H460細(xì)胞凋亡
　　 隨著SIN處理時(shí)間的逐漸延長,ERK1/2、p-ERK1/2、Akt、p-Akt表達(dá)逐漸上升。表

11、明SIN處理可以誘導(dǎo)MEK/ERK以及PI3K-AKT通路的活化。PD98059+SIN組、LY294002+SIN組與單純SIN組相比,所誘導(dǎo)的凋亡明顯升高,與之相比有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。結(jié)果表明MEK/ERK以及PI3K/AKT通路抑制劑拮抗了其通路活化所發(fā)揮的抗凋亡作用,對青藤堿誘導(dǎo)的凋亡具有協(xié)同作用。
　　 結(jié)論
　　 1、青藤堿可以抑制肺癌細(xì)胞系NCI-H460的增殖,這種抑制作用具有時(shí)間和濃度依

12、賴性。青藤堿抑制肺癌細(xì)胞系NCI-H460的增殖是通過誘導(dǎo)其凋亡來實(shí)現(xiàn)的。
　　 2、青藤堿可能通過線粒體途徑誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞系NCI-H460的凋亡。青藤堿可能通過調(diào)控Bcl-2家族蛋白的表達(dá),改變線粒體膜通透性,導(dǎo)致Cytochrome c從線粒體釋放入胞漿,從而激活線粒體途徑而誘發(fā)的細(xì)胞凋亡。
　　 3、SIN處理后誘導(dǎo)NCI-H460細(xì)胞凋亡過程中,伴隨著MEK/ERK以及PI3K/Akt通路的活化。應(yīng)用MEK/ER