放射配基分析法對人食管下括約肌M受體與配基親和力的研究.pdf

1、目的：食管下括約肌(LES)是食管胃連接部特殊增厚的肌束，由位于胃小彎側呈半環(huán)形的鉤狀纖維(clasp fibres)和位于大彎側呈斜行分布的套索纖維(sling fibres)共同構成，這兩束肌纖維協(xié)同維持LES的關閉狀態(tài)，并在食管胃結合部形成LES高壓帶。人體LES起著單方向開放的括約肌作用，正常狀態(tài)下，由于高壓帶的阻隔胃內容物不能反流入食管，另一方面，由于LES高壓帶的適時降壓開放允許了食物繼續(xù)下行入胃，或者嘔吐的發(fā)生和胃內氣體的

2、排出。LES的收縮和舒張功能調節(jié)機制非常復雜，包括了神經、體液及自身肌源性等多種因素。乙酰膽堿是控制LES收縮的最主要神經遞質，它通過分布在平滑肌纖維上的毒蕈堿型受體(M受體)起調節(jié)作用。M受體廣泛存在于全身各平滑肌中，包括胃腸道，它在維持全身平滑肌收縮狀態(tài)時起主要作用。目前M受體家族移交明確的按藥理分型為M1、M2、M3、M4，或按分子生物學分型為m1、m2、m3、m4和m5五種亞型。其中主要分布在平滑肌纖維膜上的主要M受體亞型為M2

3、和M3，M2數(shù)量占75％-80％，但M3受體是主要功能類型。本試驗采用放射性配基受體結合分析法(Radio Ligand Binding Assay,RLBA)研究人食管下括約肌M受體與其配基的親和力，以進一步探討M受體及其亞型在人LES調節(jié)機制中聽發(fā)揮的作用。 方法：選取2007年5月至2007年12月在河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院因高位食管中段癌行食管大部切除術患者8例，采集未受侵的套索纖維和鉤狀纖維，制成約(2～4)mm×(8～1

4、2)mm的肌條，1)4℃條件下用組織勻漿器加入TBS液勻漿，勻漿液(4℃，1000×g)離心10分鐘。2)棄上清后，以美國PIERCE公司的膜蛋白提取試劑盒將沉淀運用膜蛋白萃取法制備受體膜蛋白，反應緩沖液稀釋，考馬斯亮藍G-250定量，然后存于-80℃?zhèn)溆谩?)以3H-QNB為標記配基，Atropine為拮抗劑，反應體系總體積250 μl，使得3H-QNB與M受體充分結合，37℃恒溫孵育40min，進行飽和試驗。4)以Methoctra

5、mine和4-DAMP為M2和M3受體拮抗劑，以上述反應體系重復前面的過程進行競爭抑制試驗。5)以49型玻璃纖維濾膜采用負壓抽濾的辦法分離結合和游離配基，將含有結合配基的受體的濾膜置于液體閃爍計數(shù)儀中計數(shù)。實驗結果采用Graphpad Prism4.03軟件繪制濃度效應曲線及競爭抑制曲線，并計算平衡解離常數(shù)Kd，最大結合量Bmax和半效抑制濃度IC50；用SPSS 13.0軟件分析實驗結果，以P≤0.05有顯著性差異。 結果：

6、 1.飽和結合試驗：分別得出M受體在套索纖維和鉤狀纖維的飽和曲線，并得出在LES的套索纖維上3H-QNB與M受體的最大結合量Bmaxs為568.2±5.28cpm，平衡解離常數(shù)Kds為1.049±0.054mmol/L，而在鉤狀纖維上二者的最大結合量Bmaxc為557.9±10.41cpm，Kdc為1.033±0.045mmol/L。M受體與3H-QNB的最大結合量在鉤狀纖維和套索纖維上無統(tǒng)計學差意義(t=0.782，p=0.39

7、1)，平衡解離常數(shù)在鉤狀纖維和套索纖維上無統(tǒng)計學差意義(t=0.395，p=0.540)。 2.競爭抑制實驗：得出M2受體和M3受體拮抗劑分別在套索纖維和鉤狀纖維的競爭抑制曲線，同時在LES的套索纖維上Methoctramine的半量有效抑制濃度IC50Methoctramine為5.422±0.1 12× 10-6mol/L，4-DAMP的半量有效抑制濃度Ic504-DAMP為1.658±0.071 × 10-6mol/L，二者對3H

8、-QNB和M2、M3受體結合的抑制作用有統(tǒng)計學差異(t=6.26，p=0.025)，而在鉤狀纖維上Methoctramine的半量有效抑制濃度IC50Mdthoctramine為1.993±0.065 × 10～mol/L，4-DAMP的半量有效抑制濃度IC504-DAMP為5.680±0.105× 10-6mol/L，二者對3H-QNB和M2、M3受體結合的抑制作用有統(tǒng)計學差異(t=7.21，p=0.037)，且4-DAMP的抑制作用

9、強于Methoctramine。但是Methoctramine在鉤狀纖維和套索纖維上的抑制作用無統(tǒng)計學差異(t=0.079，p=0.783)，4-DAMP在鉤狀纖維和套索纖維上無統(tǒng)計學差異(t=0.024，P=0.878)。 結論： 1.3H-QNB與人LES平滑肌纖維膜上的M受體為特異性結合，M受體與3H-QNB的親和力套索纖維和鉤狀纖維上的分布無差別。 2.M3受體的拮抗劑4-DAMP對3H-QNB與人LES