應(yīng)用膜片鉗技術(shù)對人食管下括約肌鈣離子通道的研究.pdf

1、目的：醫(yī)學(xué)界對食管下括約肌(lower esophagealsphincter,LES)是否存在及其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的探討經(jīng)歷了一個(gè)很長的發(fā)展過程。直到1979年，Liebermann-Meffert等學(xué)者通過對32例尸體標(biāo)本的解剖研究，詳細(xì)闡述了食管胃連接部(esophagogastric junction，EGJ)平滑肌束的宏觀排列，提出人類LES的肌肉系統(tǒng)由套索纖維(sling fibers)和鉤狀纖維(claspfibers)共同構(gòu)成。

2、鉤狀纖維位于LES右側(cè)，呈半環(huán)形，套索纖維是一組不完整的U形肌束懸掛于胃食管交界部，食管下端的左側(cè)，His角上方。它的開口側(cè)位于胃小彎，閉口側(cè)位于胃大彎。這兩束肌肉共同維持LES的關(guān)閉狀態(tài)，并形成了LES高壓帶(high-pressure zone，HPZ，1 5-30mmHg)。這一理論為進(jìn)一步研究LES的生理、病理和藥理學(xué)特性奠定了基礎(chǔ)。隨后學(xué)者們主要對不同動(dòng)物L(fēng)ES的生理學(xué)特點(diǎn)和功能調(diào)節(jié)進(jìn)行了較為深入的探討，發(fā)現(xiàn)LES具有明顯不同

3、于其它平滑肌結(jié)構(gòu)的特性。而且更為重要的是，構(gòu)成LES的套索纖維和鉤狀纖維在諸多方面也存在著很大的差異性。因此，LES結(jié)構(gòu)或功能狀態(tài)的異常是多種食管疾病的病理基礎(chǔ)。 現(xiàn)在一般認(rèn)為，平滑肌細(xì)胞胞漿游離Ca2+在平滑肌收縮過程中起重要的“第二信使”作用。平滑肌細(xì)胞的收縮活動(dòng)依賴胞漿中Ca2+的濃度，高濃度Ca2+引起平滑肌收縮，低濃度Ca2+引起平滑肌舒張。平滑肌收縮時(shí)的Ca2+來源于細(xì)胞外液Ca2+內(nèi)流和細(xì)胞內(nèi)鈣庫Ca2+釋放(主要

4、是肌質(zhì)網(wǎng)，SR)。胞外Ca2+可通過質(zhì)膜鈣離子通道進(jìn)入細(xì)胞；胞內(nèi)Ca2+的釋放也通過鈣離子通道。鈣離子通道存在于所有可興奮細(xì)胞以及一些非興奮細(xì)胞乃至原核生物。同骨骼肌、心肌類似，鈣通道對內(nèi)臟平滑肌細(xì)胞的舒縮起著舉足輕重的作用。而平滑肌細(xì)胞膜L型鈣通道在平滑肌興奮-收縮耦聯(lián)中起重要作用，當(dāng)平滑肌細(xì)胞膜去極化時(shí)，通過L型鈣通道流入細(xì)胞內(nèi)的Ca2+是平滑肌細(xì)胞收縮的觸發(fā)因素。本研究應(yīng)用細(xì)胞膜片鉗技術(shù)(patch clamp technique

5、)對人類LES平滑肌細(xì)胞膜上鈣離子通道的類型及常見的影響因素進(jìn)行分析，并深入探討構(gòu)成LES的套索纖維和鉤狀纖維可能具有的不同生物學(xué)特征及其內(nèi)在機(jī)制?？梢栽O(shè)想，對LES的深入研究將大大有助于對賁門失弛癥、食管下括約肌高壓癥等食管運(yùn)動(dòng)功能障礙性疾病，以及胃食管反流病(gastroesophageal reflux disease，GERD)等食管良性疾病病因和病理學(xué)的理解以及治療方法的選擇。 方法：選取2007年1月至2007年12

6、月在河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院因食管中段癌行食管大部切除術(shù)患者22例，其中男性13例，女性9例，平均年齡57.3歲。手術(shù)室采集新鮮手術(shù)標(biāo)本，銳性剝?nèi)ノ纲S門部及食管下段的粘膜層及粘膜下層后，制備套索纖維、鉤狀纖維的肌條，將肌條剪成2mm3的小塊，用含膠原酶Ⅱ和木瓜酶的細(xì)胞分離液分離出單個(gè)平滑肌細(xì)胞。確認(rèn)分離細(xì)胞活性在95％以上。然后用37℃Hepes緩沖液懸浮備用。 細(xì)胞存活率測定：取5滴細(xì)胞懸浮液，加1滴0.2％的臺(tái)盼藍(lán)溶液，混勻3

7、min內(nèi)計(jì)數(shù)，當(dāng)細(xì)胞死亡時(shí)將被染成紅色，活細(xì)胞無色。用以下公式計(jì)算細(xì)胞存活率：存活率(％)=活性細(xì)胞總數(shù)P/(活性細(xì)胞數(shù)+死細(xì)胞數(shù))×100％。將細(xì)胞灌流槽固定于倒置顯微鏡的工作臺(tái)上，吸取急性分離的平滑肌細(xì)胞懸液數(shù)滴于灌流槽中，待細(xì)胞貼壁后，用鈣電流相應(yīng)的灌流液灌流，選取表面光潔、邊緣整齊，光滑的，靜止不動(dòng)，立體感強(qiáng)的細(xì)胞為研究對象。記錄電極由硬質(zhì)玻璃毛坯經(jīng)水平拉制儀(Sutter P-97，USA)四步拉制而成，內(nèi)充鈣離子電極內(nèi)液后阻

8、抗為2～3M Ω。采用三維液壓微操縱器將電極靠近細(xì)胞進(jìn)行封接，負(fù)壓吸引致封接阻抗達(dá)1GΩ以上，吸破細(xì)胞膜，補(bǔ)償電容電流和電極串聯(lián)電阻，形成全細(xì)胞記錄模式。脈沖信號由pulse+pulsefit軟件(HEKA，version 8.53，法耳次，德國)控制，通道信號經(jīng)EPC-9膜片鉗放大器(HEKA，法耳次，德國)放大，通過Ag-AgC1電極絲和填充電極內(nèi)液的微電極導(dǎo)入細(xì)胞，產(chǎn)生的電流信號經(jīng)EPC-9轉(zhuǎn)換，為pulse+pulsefit軟件

9、收集、分析，收集到的數(shù)據(jù)采用Origin 7.5擬合。所有實(shí)驗(yàn)在室溫(25℃)下進(jìn)行。所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x-)±s)表示，兩組均數(shù)的比較用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，通過軟件SPSS 13.0(SPSS公司，芝加哥，美國)完成。以P＜0.05為差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性意義。 結(jié)果：1 單個(gè)LES細(xì)胞的形狀在倒置顯微鏡下，新鮮分離的食管下括約肌套索纖維及鉤狀纖維平滑肌細(xì)胞呈梭形，長短不一。在Hepes緩沖液中，部分平滑肌細(xì)胞完全舒

10、張，部分處于不同程度的收縮狀態(tài)，二者均有一個(gè)中心核(Fig.2～3)。套索纖維細(xì)胞平均長度為101.1±27.2μm(51～148μm，n=200)；鉤狀纖維平滑肌細(xì)胞長度為99.5±23.6μm(48～146μm，n=200)。二者比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＞0.05(t=0.247，P=0.676)。 2 I-V曲線將細(xì)胞鉗制在-60mV或-90mV，以10mV的階躍刺激細(xì)胞去極化從-80～+30mV，波寬為200ms?？捎涗浀揭粌?nèi)向電流，

11、在刺激開始后5～13ms時(shí)出現(xiàn)，在I-V曲線中0mV達(dá)到峰值，在約-50mV處翻轉(zhuǎn)。兩者的IV曲線均呈U型，只不過峰值不同，在鉗制電位為-60mV時(shí)為-5.58±1.53pA/Pf(n=6 cells)，顯著低于鉗制電位為-90mV的內(nèi)向電流-7.02±0.93pA/pF(n=6cells)，P＜0.05(t=1.970，P=0.043)。并且套索纖維及鉤狀纖維平滑肌細(xì)胞的記錄電流未發(fā)現(xiàn)不同。 3.Nifedipine對內(nèi)向電流

12、的影響Nifedipine可顯著抑制內(nèi)向電流，鉗制電壓為-60mV和-90mV時(shí)，10μm Nifedipine幾乎可完全取消內(nèi)向電流(-0.44±0.73pA/pF&-1.47±1.23 pA/pF，n=6 cells)。和正常電流相比P＜0.05(t=7.427，P=0.000&t=8.816，P=0.000)。在0.1、1、5μm時(shí)也發(fā)現(xiàn)相同的趨勢。 結(jié)論：1.套索纖維和鉤狀纖維肌細(xì)胞形態(tài)類似，長度相當(dāng)。 2.人L