姜黃素對(duì)肺癌細(xì)胞增殖、凋亡、促血管生成和放射敏感性的作用及其機(jī)制的體外研究.pdf

1、肺癌是世界上發(fā)病率及死亡率較高的惡性腫瘤之一，人們?cè)噲D從中藥有效成分中尋找一種高效、低毒，能抑制腫瘤細(xì)胞增殖誘導(dǎo)其凋亡且對(duì)放射具有增敏作用的藥物，從而為肺癌的臨床治療提供一種新途徑。 姜黃素(Curcumin，Cur)是從姜科姜黃屬植物姜黃(curcumalonga)根莖中提取的一種酚類色素，大量研究表明，姜黃素具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多種生物學(xué)功能，且價(jià)格低廉，毒性很低，目前對(duì)其抗腫瘤作用的研究主要集中在腫瘤的化學(xué)預(yù)防方面。

2、 一、姜黃素抑制人肺癌細(xì)胞(A2)生長、誘導(dǎo)凋亡的作用及其機(jī)制 (一)實(shí)驗(yàn)方法: 1、細(xì)胞培養(yǎng)。 2、MTT法藥物敏感試驗(yàn)消化細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24h后，分別加入含不同濃度姜黃素的RPMI1640培養(yǎng)液100μ1，培養(yǎng)48h后，每孔加入5mg/mlMTT20μl，用酶標(biāo)儀檢測OD值，檢測波長為490nm。 3、Annexin-FITC標(biāo)記法定量檢測細(xì)胞凋亡收集細(xì)胞，清洗，離心，加入結(jié)合b

3、uffer，重懸細(xì)胞。 4、細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測細(xì)胞經(jīng)2.5％戊二醛、1％鋨酸雙固定，梯度乙醇和丙酮脫水，Epon812樹脂包埋超薄切片機(jī)(AO型)切片，醋酸鈉和檸檬酸鉛雙重染色，JEM-1200EX和H-600型透射電鏡下觀察并拍照。 5、細(xì)胞總DNA的提取及瓊脂糖凝膠電泳收集細(xì)胞，重懸，離心，去上清，重復(fù)一次。 6、Westem blot檢測A2細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、P53、survivin、F

4、as收集細(xì)胞，裂解，測蛋白濃度，定蛋白，10％SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)印，TBS封閉，轉(zhuǎn)到Bcl-2、Bax、P53、Fas及survivin一抗4℃，過夜。 (二)結(jié)果: 1、MTT法藥物敏感試驗(yàn)姜黃素對(duì)A2細(xì)胞的抑制作用呈濃度依賴性，計(jì)算48小時(shí)的IC50值為40μmol/L。 2、細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測透射電鏡下觀察，對(duì)照組A2細(xì)胞中細(xì)胞核及線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等結(jié)構(gòu)清晰，核占細(xì)胞體積的大部分。 3、Ann

5、exin-FITC標(biāo)記法定量檢測細(xì)胞凋亡分別收集姜黃素40μmol/L 作用24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)及正常對(duì)照組的細(xì)胞進(jìn)行Annexin V-FITC標(biāo)記結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。 4、DNA瓊脂糖凝膠電泳分別收集姜黃素40μmol/L作用24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)及正常對(duì)照組的細(xì)胞進(jìn)行DNA瓊脂糖電泳。 5、Westem blotting分別收集姜黃素40μmol/L作用6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)及正

6、常對(duì)照組的細(xì)胞，提取總蛋白，檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)隨時(shí)間的延長，Bax、P53、Fas蛋白表達(dá)水平逐漸升高。而Bcl-2、survivin蛋白表達(dá)水平逐漸降低。 總之：姜黃素誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞株A2細(xì)胞凋亡是多靶點(diǎn)，多途徑的，其與凋亡相關(guān)基因的改變、細(xì)胞因子的分泌等密切相關(guān)。 二、姜黃素對(duì)血管生成的作用及其機(jī)制的研究 (一)實(shí)驗(yàn)方法: 1、細(xì)胞培養(yǎng)用含10％56℃滅活胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，37

7、℃飽和濕度、5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，HUVEC、A2細(xì)胞呈單層貼壁生長，實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞。 2、MTT法觀察姜黃素對(duì)HUVECs增殖的影響細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24h后，分別加入含不同濃度姜黃素的RPMI1640培養(yǎng)液。 3、Annexin-FITC標(biāo)記法定量檢測細(xì)胞凋亡消化收集細(xì)胞，加入結(jié)合buffer，重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)。 4、逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測血管生成素1和血管生成素2(Ang-1、Ang-2)

8、和血小板反應(yīng)素(TSP)的mRNA水平細(xì)胞總RNA提取，采用紫外光譜掃描儀檢測總RNA純度；逆轉(zhuǎn)錄；PCR產(chǎn)物分析：取PCR產(chǎn)物在2％瓊脂糖凝膠上電泳，電泳結(jié)果以Ang-1、Ang-2和TSP分別與β-actin條帶的吸光度比值表示Ang-1、Ang-2和TSP的mRNA的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度。 5、Western blot檢測VEGF、MMP-9蛋白的表達(dá)收集細(xì)胞，裂解，測蛋白濃度，定蛋白，10％SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)印，TBS封閉

9、，轉(zhuǎn)到VEGF、MMP-9一抗4℃，過夜。 (二)結(jié)果 1、姜黃素處理HUVEC細(xì)胞后MTT法檢測結(jié)果姜黃素對(duì)HUVEC細(xì)胞增殖抑制作用呈量效關(guān)系：不同濃度姜黃素對(duì)培養(yǎng)的人血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖有顯著抑制作用。隨著姜黃素濃度的增加，作用時(shí)間的延長，其抑制作用增強(qiáng)。 2、姜黃素對(duì)HUVECs凋亡的影響流式細(xì)胞術(shù)檢測不同濃度姜黃素對(duì)HUVECs凋亡的影響。 2、RT-PCR分別收集姜黃素40μmol/L 作用6小

10、時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)及正常對(duì)照組的細(xì)胞，提取RNA，檢測血管生成素-1(Ang-1)、血管生成素-2(Ang-2)及血小板反應(yīng)素(TSP)的mRNA的表達(dá)，可見隨姜黃素作用時(shí)間的延長Ang-1、Ang-2mRNA的表達(dá)明顯低于對(duì)照組；TSP的mRNA的表達(dá)高于對(duì)照組。 4、Westem blotting分別收集姜黃素40μmol/L 作用6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)及正常對(duì)照組的細(xì)胞，提取總蛋白，檢測VEGF

11、及MMP9蛋白的表達(dá)顯著低于對(duì)照組。 總之，姜黃素可能通過多種信號(hào)途徑抑制血管生成：①降低腫瘤細(xì)胞血管生成因子(VEGF， Ang-1，Ang-2)和(或)提高抑制因子(TSP-1)的表達(dá)水平來調(diào)控血管生成因子的平衡，抑制血管生成的表型轉(zhuǎn)換。②抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。③減少基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-9)的表達(dá)從而抑制基底膜及細(xì)胞外基質(zhì)的降解。 三、姜黃素對(duì)人肺癌(A2)細(xì)胞放療增敏的體外實(shí)驗(yàn)研究

12、 (一)實(shí)驗(yàn)方法: 1、集落形成試驗(yàn)接種細(xì)胞于培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24小時(shí)后更換含不同濃度的姜黃素培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)和48小時(shí)后，在室溫下用Cs放射源照射，照射后用藥組更換為不含藥物的培養(yǎng)液與單純照射組一起繼續(xù)培養(yǎng)9天。9天后細(xì)胞用95％乙醇固定，姬母薩染色，≥50個(gè)細(xì)胞記數(shù)為一個(gè)存活集落，對(duì)每個(gè)測量點(diǎn)實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次。 3、細(xì)胞凋亡檢測細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，設(shè)空白對(duì)照(即單純放射組)，實(shí)驗(yàn)組(即藥物加放射組)不同濃度的姜

13、黃素，培養(yǎng)24h接受2、4、6、8Gy照射后，繼續(xù)培養(yǎng)24h，取100μl細(xì)胞懸液，加入DNA-PREPTMLPR 200μl混勻，30s后加入DNA-PREP-TM染色劑(PI染色)2ml混勻。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。 4、蛋白免疫印跡法(Westem-blot)檢測周期調(diào)控因子及NF-kB蛋白水平的表達(dá)收集細(xì)胞，裂解，測蛋白濃度，定蛋白，樣品加入樣品緩沖液，10％SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)印，TBS封閉，封閉后TTBS洗2

14、次，每次5分鐘，轉(zhuǎn)到cyclinBl、P34<'cdc2>、phos-P34<'cdc2>、P21、survivin及NF-kB一抗4℃，過夜。 (二)結(jié)果: 1、細(xì)胞周期檢測血清饑餓法同步在GO期的細(xì)胞，棄無血清RPMI1640培養(yǎng)基，加入含10％胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。 2、細(xì)胞周期阻滯取血清饑餓法同步在GO期細(xì)胞，經(jīng)2小時(shí)恢復(fù)期后，分別向?qū)嶒?yàn)組的3瓶細(xì)胞每瓶中加入姜黃素40μmol/L。再取

15、恢復(fù)期后18小時(shí)的3瓶細(xì)胞，每瓶細(xì)胞中加入姜黃素，使終濃度為40μmol/L。每3小時(shí)收集一瓶細(xì)胞，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。各時(shí)間均可見凋亡標(biāo)志的亞二倍體峰。 3、不同處理因素對(duì)A2細(xì)胞凋亡的影響單純放射組和藥物加放射組分別處理A2細(xì)胞后，藥物加放射組及單純放射組均在G0+G1峰之前出現(xiàn)一個(gè)明顯的亞二倍體峰(凋亡峰)，但以藥物加放射組更為明顯。 4、Westem blotting取同步化恢復(fù)期后18小時(shí)的細(xì)胞，加入姜黃素使終

16、濃度為10μmol/L。作用3小時(shí)，再分別收集恢復(fù)期后18小時(shí)、21小時(shí)的細(xì)胞，檢測蛋白印跡，在姜黃素處理3小時(shí)后，P34、phos-P34表達(dá)量沒有改變，cyclinB、survivin及NF-kB蛋白表達(dá)量減少，P21蛋白表達(dá)量增加。 總之，姜黃素能增加肺癌細(xì)胞的放射敏感性，其機(jī)制可能為使A2細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯，及抑制NF-kB蛋白的表達(dá)；細(xì)胞發(fā)生周期阻滯與cyclinB、survivin蛋白表達(dá)量減少，P21蛋白表達(dá)量

17、增加有關(guān)。 結(jié)論: 1、姜黃素能誘導(dǎo)A2細(xì)胞凋亡，凋亡發(fā)生可能與c-myc、bcl-2、survivin蛋白表達(dá)下降；而bax、fas、p53、Caspase-3的蛋白表達(dá)升高相關(guān)。 2、姜黃素能抑制腫瘤血管生成其作用通過(1)降低腫瘤細(xì)胞血管生成因子(VEGF，Ang-1，Ang-2)和(或)提高抑制因子(TSP-1)的表達(dá)水平來調(diào)控血管生成因子的平衡，抑制血管生成的表型轉(zhuǎn)換。(2)抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，促進(jìn)