HBV CccDNA磁性捕獲雜交定量PCR方法的建立及應用評價.pdf

1、第一部分特異性HBV CccDNA功能化納米顆粒制備與鑒定
　　目的:制備特異性富集分離CcDNA功能化的磁性納米顆粒，為建立磁性捕獲雜交方法奠定基礎。
　　方法:通過化學共沉淀法制備Fe3O4納米粒子，用“溶膠”法對納米顆粒進行二氧化硅包殼。在納米顆粒表面用鏈霉親和素修飾，利用鏈霉親和素與生物素的親和作用，將鏈霉親和素修飾的納米顆粒與生物素標記的CcDNA特異性探針進行偶聯(lián)反應，制備CccDNA功能化納米顆粒，最后用FIT

2、C標記、與納米顆粒探針完全互補的序列與功能化納顆粒反應，確定CccDNA功能化納顆粒米的特性。
　　結果:
　　(1)合成的Fe3O4納米粒子近似球形，粒度分布較均勻，大小在8-25 nm(平均粒徑為13.2 nm)，粒子間無團聚現(xiàn)象，具有良好的分散性且二氧化硅包覆顆粒的分散性明顯好于單純Fe3O4顆粒。
　　(2)從SiO2包裹納米顆粒的紅外光譜圖上可看到Si-O和Fe-O的特征峰，它的飽化磁化強度為55 emu/g

3、，無磁滯和剩磁現(xiàn)象，表現(xiàn)出明顯的超順磁性現(xiàn)象。
　　(3)每mg SiO2包裹納米顆粒能固定鏈霉親和素的最大量為146μg;每mg鏈霉親和素修飾的納米顆粒能結合生物素最大量為1215 ng。
　　(4)通過鏈霉親和素-生物素的相互作用能將CccDNA特異性寡核苷酸固定在磁性納米微粒表面，偶聯(lián)前后上清液在260 nm的特征吸收峰有明顯變化，并且偶聯(lián)后上清液中核酸濃度和OD260值均明顯下降。通過OD260值變化計算出親和素修飾

4、的納米顆粒最大結合生物素標記探針量約3200 pmol/mg。
　　(5) CccDNA功能化納米顆粒與其互補FITC標記寡核苷酸序列雜交后，用熒光顯微鏡觀察到磁性分離后上清液的熒光信號明顯減弱，變性后其上清液熒光強度又明顯增強。通過熒光強度改變計算出功能化納米顆粒對互補探針最大捕獲量大約是2000 pmol/mg。
　　結論:構建的CccDNA功能化納米微粒能有效捕獲與其互補的序列，其捕獲量能達到CccDNA的分離提取要求

5、，為CccDNA定量檢測方法建立奠定了基礎。
　　第二部分 HBV CccDNA標準品的制備與定量
　　目的:通過構建HBV全基因組重組質粒來制備HBV CccDNA標準品，為CccDNA定量方法建立和性能驗證提供標準品和質控品。
　　方法:提取慢性乙肝患者血清DNA，用高保真PCR法擴增HBV全基因組片段，通過T-A克隆建立HBV全基因組質粒，以HBV全基因組質粒為模板，經酶切、連接、濃縮、膠回收及純化等手段構建HB

6、V CccDNA標準品。
　　結果:
　　(1)從慢性乙肝患者血清中擴增出3.2 kb左右大小的DNA片段通過T-A克隆插入pMD18-T載體，成功構建重組質粒。重組質粒經HindⅢ酶消化得到預期的2.7kb和3.2 kb兩個片段;
　　(2)經測序鑒定，構建的兩個質粒分別屬HBV基因型B和C，在DR1和DR2區(qū)域內設計的4條探針序列和一條上游引物序列都與測序結果中匹配，擴增序列的保真性好，錯配率符合要求。
　　

7、(3)兩個重組質粒經酶切、連接、膠回收和純化成功構建CccDNA標準品。兩個標準品經real-time PCR定量，它們的濃度分別是1.05×1010IU/mL和6.19×109 IU/mL，分別命名為CccDNA-B和CccDNA-C。
　　結論:本部分實驗成功構建了HBV全基因組重組質粒和CccDNA標準品，經測序和定量證實，構建的標準品可以作為下一步方法建立和性能驗證的標準品和質控品。
　　第三部分 HBV CccDN

8、A磁性捕獲雜交定量PCR方法建立及初步評價
　　目的:建立磁性捕獲雜交定量PCR方法，并對該方法靈敏度、特異性、干擾、檢測線性及正確度等評價，以確認建立的方法能滿足常規(guī)檢測需求。
　　方法:設計跨缺口引物選擇性擴增磁性雜交捕獲分離的CccDNA，建立磁性捕獲雜交實時定量PCR方法，將4種不同探針磁性納米微粒與一定量的標準品雜交不同的時間(1h、2h和3h)，確定最適宜的探針和最佳雜交條件;10倍系列稀釋HBV CccDNA標

9、準品，取一定量標準品與最有效探針進行雜交分離，檢測磁性納米微粒捕獲HBV CccDNA含量，確定方法檢測靈敏度和線性;將不同濃度的CccDNA標準品與一定量干擾物混合，檢測經磁性納米微粒捕獲的HBV CccDNA含量，以確定方法檢測特異性和干擾;用建立的磁性納米微粒捕獲雜交定量PCR法檢測細胞株HepG2.2.15連續(xù)培養(yǎng)4d細胞中CcDNA含量和檢測10例血清標本中CccDNA，對方法進行初步評價。
　　結果:
　　(1)

10、4條探針均能雜交捕獲CccDNA，除25-mer探針外，其余3條探針在不同雜交時間內都能達到標準品預期濃度，其中49-mer探針在62℃1h雜交條件下能有效捕獲CccDNA，被選為后續(xù)實驗探針。
　　(2)磁性納米微粒捕獲雜交定量PCR方法檢測靈敏度為102 IU/mL(20copies/mL)，108 IU/mL RcDNA對本方法無干擾，MCH-qPCR檢測濃度與加入預期濃度之間呈明顯線性關系(R2=0.994，F(xiàn)=507.5

11、，p＜0.01)，方法正確度與特異性符合要求。
　　(3) HepG2.2.15細胞在連續(xù)培養(yǎng)4d后，MCH-qPCR檢測其上清CcDNA濃度分別是4.02×103 IU/mL、1.04×102 IU/mL、4.38×102 IU/mL和5.01×103IU/mL，質控結果符合預期，表明MCH-qPCR法能從HepG2.2.15細胞株上清中檢測出CccDNA。
　　(4)10例CHB患者標本HBV DNA濃度達107 IU/

12、mL，8例標本中檢測出CccDNA;用功能化納米微粒對Hirt法提取的tDNA進行MCH-qPCR檢測，其檢測結果顯著低于Hirt提取后的直接檢測組，差異具有顯著的統(tǒng)計學意義(p＜0.01)。
　　結論:成功建立檢測CccDNA的MCH-qPCR方法，方法檢測靈敏度低(102IU/mL)，正確度高，特異性好，符合常規(guī)檢測要求。
　　第四部 HBV CccDNA磁性捕獲雜交定量PCR法初步臨床應用
　　目的:通過MCH-

13、qPCR方法來檢測血清、肝組織及外周單個核細胞內CccDNA及分析CHB血清中CccDNA和血清HBV DNA、ALT等之間的關系，以幫助對MCH-qPCR方法臨床應用評價以及了解CccDNA在HBV感染過程中的變化。
　　方法:收集肝臟組織標本、慢性乙肝患者血清標本，經Hirt法提取總DNA后進行HBV DNA和CccDNA檢測;收集外周血標本，進行外周血單個核細胞分離后用質粒提取法提取總DNA后進行HBV DNA和CccDNA

14、檢測;分析不同標本類型中CccDNA與HBVDNA之間的關系。
　　結果:
　　(1)28例肝組織標本中，21例標本檢測出HBV DNA，15例標本檢測出HBVCccDNA，它們之間存在明顯正相關(p＜0.01，R2=0.824)。
　　(2)21例乙肝患者外周血標本中，PBMCs內檢測出HBV DNA共7例，檢出率33.3％;檢測出CccDNA共4例，檢出率為19.0％。血清HBV DNA與PBMCs內CccDNA及

15、HBV DNA濃度對數(shù)值無相關性(R2=0.111和R2=0.104)。
　　(3)82例乙肝患者血清標本中，檢測出CccDNA共48例，檢出率為58.5％。35例HBeAg陰性CHB患者有12例血清標本中檢測出CccDNA，檢出率為34.3％;47例HBeAg陽性CHB患者有36例標本血清檢測出CccDNA，檢出率為76.6％。ALT水平高低對于CccDNA檢測結果無明顯影響(pearson=0.04，p=0.851＞0.05)

16、。所有82樣本HBVDNA與CccDNA之間僅弱的相關性(R2=0.24，F(xiàn)=15.165，p＜0.05); HBeAg陽性組HBV DNA與CccDNA間也有弱的相關性(R2=0.167，F(xiàn)=7.613，p＜0.05);HBeAg陰性組HBV DNA與CccDNA間沒有相關性(R2=0.042，F(xiàn)=0.352p＞0.05)。
　　結論:MCH-qPCR方法從肝組織、外周血單個核細胞及血清中均可檢測出CccDNA，肝組織中CccD