rpoB基因-PCR-反向斑點(diǎn)雜交快速鑒定分枝桿菌菌種的研究.pdf

1、分枝桿菌的rpoB基因是分枝桿菌依賴(lài)DNA的RNA聚合酶的β亞單位的編碼基因序列，rpo(RNApolymerase，RNA聚合酶)是由αββ‘σ四個(gè)亞單位形成的寡聚體，其核心酶是α2ββ‘的聚合體，全酶為α2ββ‘σ聚合體。核心酶α2ββ‘就可完成RNA聚合酶的功能，但是需要σ亞單位在轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)區(qū)確定轉(zhuǎn)錄起始位置，編碼αββ‘σ亞單位的基因就被分別稱(chēng)為rpoA、rpoB、rpoC、rpoD基因。 結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv的R

2、NA聚合酶β亞單位由1178個(gè)氨基酸組成，編碼它的ORF(openreadingframe，開(kāi)放閱讀框)長(zhǎng)度為3534bp，我們選用其第902-1261堿基，長(zhǎng)度為360bp的片段為目的基因。其兩端序列在分枝桿菌種間保守(擴(kuò)增引物根據(jù)其序列確定)，中間包含兩個(gè)序列高變區(qū)，可以作為菌種鑒定的靶序列。 使用rpoB基因引物Ⅰ、引物Ⅱ?qū)?4種分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株、8種非分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株以及37株分枝桿菌臨床分離株標(biāo)本進(jìn)行rpoB基因擴(kuò)增。24

3、種分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株、37株臨床分離株均出現(xiàn)擴(kuò)增，經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳可見(jiàn)一條360bp擴(kuò)增條帶。8種非分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株中的甲型溶血性鏈球菌和假白喉棒狀桿菌標(biāo)準(zhǔn)株出現(xiàn)少量擴(kuò)增。 根據(jù)已知的各種分枝桿菌菌種rpoB基因序列、文獻(xiàn)報(bào)道及自行補(bǔ)充測(cè)序，設(shè)計(jì)了21種分枝桿菌寡核苷酸探針。將探針點(diǎn)膜應(yīng)用反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)檢測(cè)了擴(kuò)增的24種分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株、37株分枝桿菌臨床分離株以及出現(xiàn)擴(kuò)增的2種非分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株(甲型溶血性鏈球菌，假白喉棒狀桿菌標(biāo)

4、)。 所有探針均只和相應(yīng)菌種雜交，僅偶然分枝桿菌探針(pFor)與海分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株擴(kuò)增產(chǎn)物發(fā)生交叉雜交，但海分枝桿菌探針(pMar)與偶然分枝桿菌擴(kuò)增產(chǎn)物無(wú)雜交，并不影響對(duì)鑒定結(jié)果的判讀。甲型溶血性鏈球菌和假白喉棒狀桿菌標(biāo)準(zhǔn)株擴(kuò)增產(chǎn)物與各分枝桿菌探針無(wú)雜交。 其中37株臨床分離株經(jīng)PCR-反向斑點(diǎn)雜交鑒定為12株結(jié)核分枝桿菌，7株胞內(nèi)分枝桿菌，7株膿腫分枝桿菌，6株瘰疬分枝桿菌，2株堪薩斯分枝桿菌，1株戈登分枝桿菌，1株

5、偶然分枝桿菌，1株只與屬探針(pMyc)雜交鑒定為分枝桿菌屬。其中30株與常規(guī)鑒定結(jié)果相符，其余7株經(jīng)過(guò)DNA測(cè)序判定與探針雜交鑒定結(jié)果相符。 實(shí)驗(yàn)所用引物對(duì)分枝桿菌擴(kuò)增敏感性及特異性良好，所試分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株及臨床株均出現(xiàn)360-bp擴(kuò)增片段，甲型溶血性鏈球菌和假白喉棒狀桿菌出現(xiàn)擴(kuò)增片段，但該片段與探針無(wú)雜交。所用探針能鑒定包括臨床常見(jiàn)分枝桿菌在內(nèi)的20種分枝桿菌。其中有能將16SrRNA基因無(wú)法鑒別的堪薩斯分枝桿菌和胃分枝桿菌