轉(zhuǎn)PRL基因小鼠模型的構(gòu)建與Stat5a的乳腺發(fā)育調(diào)控機理研究.pdf

1、催乳素(prolactin，PRL)是一種多肽類激素，具有促進乳腺發(fā)育、啟動并維持泌乳的功能。PRL的生理功能主要通過PRLR-JAK/Stat5信號通路介導(dǎo)，而PRL、PRLR、Stat5a、Stat5b基因是介導(dǎo)乳腺發(fā)育及乳汁分泌信號通路所必須的因子。Stat5a和Stat5b均為PRL的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)因子，兩者間可形成同源或異源二聚體，調(diào)節(jié)靶基因的表達。研究發(fā)現(xiàn)，在PRL對乳腺的調(diào)控過程中，Stat5a是主要的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)蛋白，參與

2、調(diào)控乳腺細胞增殖與分化，但對其具體調(diào)控機制尚不清楚。為了探討通過乳腺特異性表達外源PRL基因提高轉(zhuǎn)基因水牛奶品質(zhì)或奶產(chǎn)量的可行性，本研究首先構(gòu)建并篩選了乳腺特異性表達PRL基因載體，建立了轉(zhuǎn)PRL基因小鼠模型并對其進行了分析鑒定。同時，通過尋找轉(zhuǎn)錄因子Stat5a的靶基因，探討了其調(diào)控乳腺細胞增殖與分化的作用機理。
　　一、乳腺特異性表達PRL基因載體構(gòu)建
　　為篩選得到適用于體細胞核移植和原核注射的乳腺特異性表達PRL轉(zhuǎn)基

3、因載體，采用加有His標簽和凝血酶識位點的特異性引物，通過RT-PCR方法從成年雌性水牛垂體組織中擴增得到不含信號肽的長804 bp的PRL基因片段。以在KpnⅠ和SacⅠ位點插入有BCNpolyA序列的pMD18-T載體為骨架，依次連接插入PRL基因、酪蛋白(BCN)啟動子(3.8BCN或5.2BCN)、標記或篩選基因元件(cmv-EGFP-SV40polyA-SV40polyA、cmv-EGFP-SV40polyA-SV40-neo

4、-SV40polyA或cmv-EGFP-IRES-neo-SV40 polyA)3個片段，構(gòu)建獲得5個乳腺特異性表達水牛PRL基因的載體。將5個載體分別瞬時轉(zhuǎn)染Bcap37細胞，分析各載體在細胞水平上外源基因的表達情況。結(jié)果顯示，除p3.8BCN-PRL-BCNpolyA-cmv-EGFP-SV40polyA-SV40-neo-SV40polyA載體外，其余4個載體均可在Bcap37細胞中表達外源PRL基因。細胞轉(zhuǎn)染樣品Western

5、Blot分析發(fā)現(xiàn)，5.2BCN載體的PRL蛋白表達水平高于3.8BCN載體?？紤]到不同轉(zhuǎn)基因動物制備方法的需要，選擇p5.2BCN-PRL-BCNpolyA-cmv-EGFP-SV40 polyA載體備用于原核注射法生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因小鼠模型，選擇適于細胞篩選的p5.2BCN-PRL-BCNpolyA-cmv-EGFP-IRES-neo-SV40polyA載體為核移植法用轉(zhuǎn)基因載體結(jié)構(gòu)。
　　二、乳腺特異性表達PRL基因小鼠模型的建立與分

6、析
　　將p5.2BCN-PRL-BCNpolyA-cmv-EGFP-SV40polyA載體進行線性化處理后，通過原核注射法將質(zhì)粒注入到FVB小鼠受精卵內(nèi)，共獲得8只攜帶有外源基因的首建鼠?；铙w熒光及爪尖熒光檢測結(jié)果顯示，部分小鼠可觀察到明顯的綠色熒光信號。PRL和cmv片段的PCR擴增結(jié)果顯示，部分小鼠可擴增得到長752 bp的PRL基因片段以及長599bp的cmv啟動子片段;Southern Blot進一步驗證了PCR檢測為陽

7、性的小鼠基因組中整合有外源基因。繁殖的部分F2代小鼠，在長波UV燈下部分小鼠發(fā)出明顯的綠色熒光。外源基因拷貝數(shù)的Q-PCR分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，UV燈下有明顯綠色熒光的小鼠外源基因拷貝數(shù)達到十個以上，無明顯熒光小鼠的拷貝數(shù)僅為2個。外源基因整合位點的Gene Walking檢測結(jié)果顯示，有明顯綠色熒光小鼠的外源基因插入位點上下游20kb附近不存在其他基因。以上結(jié)果表明，采用原核注射法可生產(chǎn)轉(zhuǎn)PRL基因的小鼠，且外源基因在轉(zhuǎn)基因小鼠后代中可穩(wěn)定地

8、遺傳。
　　對轉(zhuǎn)基因小鼠中外源PRL蛋白表達情況、表達PRL對轉(zhuǎn)基因小鼠泌乳及安全性的影響進行了進一步分析。轉(zhuǎn)基因小鼠主要臟器組織的WesternBlot分析發(fā)現(xiàn)，外源PRL蛋白僅在小鼠乳腺及乳汁中表達。ELISA分析結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因小鼠乳汁中PRL蛋白含量為611.74～2773.96μIU/ml，是野生型小鼠的77.92～706.80％倍;平均含量為769.24μIU/ml，是野生型小鼠的223.73％倍。 QRT-PCR分析

9、發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因小鼠乳腺中乳蛋白(CSN2)和乳糖(B4galt1)基因表達水平顯著上升（P≤0.01）。ELISA法分析血清中PRL蛋白含量結(jié)果顯示，泌乳期轉(zhuǎn)基因小鼠血清中PRL蛋白含量顯著高于野生型（P≤0.01），非泌乳期無顯著差別。轉(zhuǎn)基因小鼠平均產(chǎn)仔數(shù)與野生型相比不存在顯著差異（P≥0.05）。以上結(jié)果表明，外源PRL基因僅在轉(zhuǎn)基因小鼠乳腺特異性表達，其表達可在泌乳期促進乳腺中乳蛋白和乳糖相關(guān)基因的表達，且對轉(zhuǎn)基因小鼠的生存和繁殖性

10、能無不良影響。
　　三、轉(zhuǎn)錄因子Stat5a靶基因的篩選與分析
　　為尋找與小鼠乳腺發(fā)育相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Stat5a的靶基因，在利用QRT-PCR分析Stats在乳腺不同發(fā)育時期表達結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用ChIP-seq和RNA-seq方法對妊娠后期野生型小鼠（16天，G-NC）、妊娠后期轉(zhuǎn)PRL基因小鼠（16天，G-PRL）和泌乳期轉(zhuǎn)PRL基因小鼠（7天，L-PRL）3個樣本進行了深入分析，構(gòu)建了G-NC VS G-PRL、G-P

11、RL VS L-PRL2個對比組。ChIP-seq數(shù)據(jù)中，3個樣本均得到了25M以上的Reads，其中唯一定位的Reads有20M以上，占總Reads的78％以上。G-NC、G-PRL和L-PRL3個樣本掃描分別得到218、234和160個Peaks，平均Peak長度約1kb。GO分析發(fā)現(xiàn)，Peaks相關(guān)基因在生物過程方面主要與細胞過程、代謝過程、組織信號過程等關(guān)系最為緊密;在分子功能方面，主要與結(jié)合、催化活性、分子傳導(dǎo)活性等關(guān)系密切。

12、RNA-seq測序后，每個樣本均得到11M以上的Reads，其中唯一定位的Reads有8M左右，數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)測序量達到飽和、Reads覆蓋度高、隨機性好，得到了良好的RNA-seq數(shù)據(jù)。表達差異基因分析發(fā)現(xiàn)，與G-NC相比，G-PRL樣本中有253個基因表達上調(diào)，414個基因表達下調(diào);與G-PRL相比，L-PRL樣本中有157個基因表達上調(diào)，2180個基因表達下調(diào)。對表達差異的基因進行GO分析發(fā)現(xiàn)，在生物過程方面，2個對比組表達差異的基

13、因均主要與細胞過程、代謝過程、生物調(diào)控等關(guān)系最為緊密，在分子功能方面，均與結(jié)合、催化活性、分子傳導(dǎo)活性等關(guān)系最為密切，該結(jié)果與ChIP-seq數(shù)據(jù)分析中Peaks相關(guān)基因的GO分析結(jié)果基本一致，由此說明，轉(zhuǎn)錄因子Stat5a的結(jié)合與其結(jié)合位點相關(guān)基因的表達水平密切相關(guān)。
　　對ChIP-seq和RNA-seq數(shù)據(jù)進行聯(lián)合分析，共發(fā)現(xiàn)10個受Stat5a調(diào)控的靶基因。G-PRL與L-PRL樣本數(shù)據(jù)對比發(fā)現(xiàn)，Stat5a在小鼠妊娠后期

14、與Erbb4、Tnfrsf13c、Gabrp、Arrdc4、Pvt1、AI848285基因的靶位點結(jié)合并上調(diào)這些基因的表達;Stat5a在妊娠后期與Lgr6、Ptprv基因的靶位點1結(jié)合，上調(diào)這些基因表達，在泌乳期與靶位點2結(jié)合，下調(diào)這2個基因表達。G-NC與G-PRL樣本數(shù)據(jù)對比發(fā)現(xiàn)，妊娠后期，野生型小鼠的Stat5a與Ceacam2和Atp2b2基因的靶位點1結(jié)合，下調(diào)了基因的表達;外源PRL的表達使得Stat5a與其靶位點脫離，上

15、調(diào)了這些基因的表達。這些結(jié)果表明，Stat5a在小鼠妊娠后期通過與Erbb4、Tnfrsf13c和Lgr6等與細胞有絲分裂、細胞凋亡和細胞分化等功能相關(guān)基因的靶位點結(jié)合，上調(diào)這些基因的表達，并進而通過這些基因所參與的信號通路，包括Shc/Grb2/Soc-Rac-Raf-MPK、NF-KAPPA和Wnt等發(fā)揮調(diào)控乳腺細胞增殖與分化的功能。
　　上述結(jié)果表明，通過乳腺特異性表達PRL基因可以提高轉(zhuǎn)基因動物的奶品質(zhì)或奶產(chǎn)量，PRL胞內(nèi)