TcpC對(duì)腎盂腎炎模型小鼠腎臟DCs分化成熟的影響.pdf

1、目的:
　　泌尿道感染（urinary tract infection，UTI）是臨床上最常見的感染性疾病之一，主要由細(xì)菌自尿道逆行所致，易復(fù)發(fā)。部分重癥患者可導(dǎo)致腎功能衰竭。有研究表明，導(dǎo)致泌尿道感染的病原菌近80％為大腸埃希菌。尿路致病性大腸埃希菌CFT073菌株可分泌一種含有Toll/interleukin1 receptor結(jié)構(gòu)域的蛋白(TcpC)，與大腸埃希菌所致腎盂腎炎的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Toll樣受體(TLR)是一類

2、主要表達(dá)于巨噬細(xì)胞、DCs等抗原提呈細(xì)胞的模式識(shí)別受體，可識(shí)別和結(jié)合相應(yīng)的病原相關(guān)分子模式，激活信號(hào)傳導(dǎo)，介導(dǎo)免疫應(yīng)答。TcpC可直接與MyD88結(jié)合，阻斷TLR信號(hào)通路，抑制NF-κB的激活，抑制巨噬細(xì)胞的功能，改變宿主固有免疫應(yīng)答功能狀態(tài)，從而增強(qiáng)細(xì)菌的毒力，在大腸埃希菌所致腎盂腎炎中發(fā)揮重要作用。
　　在感染性疾病中，機(jī)體通過免疫系統(tǒng)來識(shí)別和清除入侵的病原微生物，其過程十分復(fù)雜，包括固有免疫和適應(yīng)性免疫。樹突狀細(xì)胞（dend

3、ritic cells，DCs）是迄今所知功能最強(qiáng)的專職抗原提呈細(xì)胞，在免疫應(yīng)答的首要環(huán)節(jié)即抗原提呈中起重要作用。未成熟DCs具有極強(qiáng)的抗原攝取、處理和加工能力，而成熟DCs具有很強(qiáng)的抗原提呈功能，主要參與細(xì)胞免疫和T細(xì)胞依賴的體液免疫應(yīng)答。同時(shí)，DCs又是固有免疫和適應(yīng)性免疫的橋梁和紐帶。DCs的免疫調(diào)節(jié)作用與其表面諸多受體分子（如TLRs和C型凝集素）相關(guān)。TLRs是重要的模式識(shí)別受體，在DCs分化成熟中發(fā)揮重要作用。TLR可特異性

4、識(shí)別細(xì)菌、蟲體、真菌和病毒等保守的PAMPs而捕獲病原體，調(diào)控DCs成熟和細(xì)胞因子分泌，從而調(diào)節(jié)抗原提呈、T細(xì)胞的激活，影響和控制固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的強(qiáng)度和質(zhì)量。而腎小管間質(zhì)內(nèi)分布大量的DCs，可通過調(diào)節(jié)固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答而清除病原體，影響腎盂腎炎的發(fā)生和發(fā)展，在腎損傷和腎炎中均起重要作用。
　　因此，研究TcpC對(duì)腎盂腎炎模型小鼠腎臟DCs分化成熟的影響，為闡明大腸埃希菌所致急性腎盂腎炎的病理生理機(jī)制提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)

5、。
　　方法:
　　1、腎盂腎炎小鼠模型的建立腹腔注射三溴乙醇麻藥，麻醉小鼠;用彎有35°角的留置針經(jīng)尿道插入膀胱，注入0.1 ml濃度為1011/ml的菌液或生理鹽水，3小時(shí)后第二次注射，3天后處死模型小鼠，取腎臟用于后續(xù)分析。本實(shí)驗(yàn)設(shè)為3組:NS組，注入生理鹽水;TcpCwt組，注入野生型CFT073菌株;TcpCdel組，注入tcpc基因敲除的CFT073菌株。
　　2、石蠟切片的制作與HE染色取材固定，沖洗，脫

6、水，透明，浸蠟，包埋，切片，貼片，拷片。HE染色:脫蠟，細(xì)胞核染色（蘇木精染色10 min;自來水洗;鹽酸酒精3-5 s;自來水洗），細(xì)胞質(zhì)染色（伊紅染色15-20 min;70％酒精;80％酒精），脫水，透明，封片。
　　3、免疫磁珠分選腎臟DCs取小鼠腎臟，剪碎，加入消化液消化25 min，過濾網(wǎng)，離心，加入5 ml Tris-NH4Cl，常溫5-10 min，離心重懸得細(xì)胞懸液;細(xì)胞計(jì)數(shù)，加入少許Buffer(PBS+0.5

7、％ FBS+2 mM EDTA)洗滌，離心，棄上清，每108個(gè)細(xì)胞用100μl Buffer重懸，每108個(gè)細(xì)胞加入100μl的CD11c+磁珠抗體，4℃孵育20min，每107個(gè)細(xì)胞加入1-2 ml Buffer洗滌，離心，棄上清，重懸;磁珠分選:將MACS分離磁鐵安裝到MACS多用支架上，并將MS分選柱放到磁鐵中，潤(rùn)洗分選柱，將細(xì)胞懸液上樣到分選柱上;用緩沖液沖洗分離柱，每次0.5ml，洗3次;取下分選柱，用1 ml Buffer洗

8、脫柱子內(nèi)的細(xì)胞，即為所要的DCs。
　　4、腎臟DCs表型變化的檢測(cè)流式細(xì)胞術(shù)分析DCs表面分子CD40、CD54、CD80、CD86、MHC-Ⅰ及MHC-Ⅱ的表達(dá)。
　　5、DC細(xì)胞培養(yǎng)將分選的各組腎臟DCs培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基（含10％ FBS，100 U/ml青鏈霉素混合液），細(xì)胞配成5×105 cells/ml，鋪于24孔板，每孔1 ml。于37℃含5％CO2的孵箱內(nèi)培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞上清液。
　

9、　6、免疫磁珠分選OT-Ⅰ和OT-Ⅱ小鼠脾臟中CD4+T及CD8+T細(xì)胞取小鼠脾臟用毛玻璃磨碎，過濾網(wǎng)，離心，加Tris-NH4Cl裂解紅細(xì)胞，離心，重懸后計(jì)數(shù)，加入磁珠抗體，孵育15 min過柱，洗柱之后將MS柱撤離磁場(chǎng)，洗脫所要的T細(xì)胞。
　　7、TcpC對(duì)DC抗原提呈功能的影響
　　(1) DCs分別與大腸桿菌CFT073野生株和tcpc基因敲除株共培養(yǎng)收集DC2.4，洗滌后配成3×105 cells/ml鋪于Tran

10、swell24孔板的下室，1 ml/孔;上室加3×106個(gè)細(xì)菌（細(xì)胞數(shù)∶細(xì)菌數(shù)=1∶10）。以3種方式處理:空白對(duì)照組，即DC2.4組;DC2.4+TcpCwt組;DC2.4+TcpCdel組。每組做3個(gè)復(fù)孔。孵箱中培養(yǎng)20 h。收集細(xì)胞用于和T細(xì)胞共培養(yǎng)。
　　(2)抗原肽特異性CD8+T或CD4+T細(xì)胞的增殖活化反應(yīng)將(1)中收集的3組DCs配成濃度為1×105 cells/ml;將分離的T細(xì)胞配成濃度為1×106 cells

11、/ml;取DCs細(xì)胞懸液100μl和T細(xì)胞懸液100μl鋪于96孔板共培養(yǎng);加入終濃度為2μg/ml的OVA257-264或OVA323-339肽;于37℃、含5％CO2的孵箱中共培養(yǎng)72 h，收集細(xì)胞上清，用于檢測(cè)細(xì)胞因子IL-2和IFN-γ的含量。
　　8、細(xì)胞因子檢測(cè)ELISA檢測(cè)腎臟組織勻漿中細(xì)胞因子CXCL-2、IL-1β及IL-6的濃度，和腎臟DCs分泌的細(xì)胞因子IL-1β、 IL-6、 IL-12及IL-23的濃度，

12、以及T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IL-2和IFN-γ的濃度。
　　結(jié)果:
　　1 TcpC能增加腎盂腎炎模型小鼠腎臟內(nèi)細(xì)菌載量，使中性粒細(xì)胞大量聚集。
　　三組小鼠腎臟組織勻漿細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TcpCwt組腎臟內(nèi)細(xì)菌量是TcpCdel組的3.5倍，而NS組中無細(xì)菌生長(zhǎng)。腎臟組織石蠟切片HE染色后觀察到TcpCwt組中有大量中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)，而TcpCdel組中中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)的較少。
　　2 TcpC能顯著增加腎盂腎炎模

13、型小鼠腎臟組織內(nèi)細(xì)胞因子CXCL-2的濃度，對(duì)IL-1β的影響不顯著，而對(duì)IL-6的分泌具有抑制作用。
　　NS組中腎臟組織內(nèi)細(xì)胞因子CXCL-2、IL-1-β和IL-6的含量分別為155.4±23.3(ng/ml)、17600.0±763.7(pg/ml)和465.6±13.8(pg/ml),TcpCwt組CXCL-2、IL-1β和IL-6含量分別為327.9±20.9(ng/ml)、19016.0±503.5(pg/ml)和6

14、16.4±26.5(pg/ml)，TcpCdel組腎臟組織內(nèi)細(xì)胞因子CXCL-2、IL-1-β和IL-6的含量分別為206.6±17.1（ng/ml）、20600.0±480.8（pg/ml）和740.2±17.1（pg/ml）。結(jié)果表明，大腸埃希菌逆行至腎臟后引起了腎臟內(nèi)細(xì)胞因子的分泌量增加，且TcpC能顯著增加腎臟組織內(nèi)趨化因子CXCL-2的含量，對(duì)IL-1-β的分泌無顯著影響，而對(duì)IL-6的分泌具有抑制作用。
　　3 Tcp

15、C抑制腎臟DCs表面分子CD40、CD80、CD86及MHC-Ⅱ的表達(dá)。
　　NS組腎臟DCs表面分子CD40、CD54、CD80、CD86、MHC-Ⅰ及MHC-Ⅱ的平均熒光強(qiáng)度(Mean fluorescence intensity，MFI)分別為49.94±4.80、43.99±1.90、39.43±1.37、58.56±2.63、65.58±5.78和138.20±10.95，TcpCwt組腎臟DCs表面分子CD40、CD5

16、4、CD80、CD86、MHC-Ⅰ及MHC-Ⅱ的平均熒光強(qiáng)度(MFI)分別為26.72±4.24、39.90±3.01、33.16±2.60、51.43±3.33、67.78±4.45和85.88±3.34，TcpCdel組DCs表面CD40、CD54、CD80、CD86、MHC-Ⅰ及MHC-Ⅱ的MFI分別為92.88±10.20、52.12±5.58、47.26±1.84、86.94±4.16、88.28±8.29和139.69±6.

17、75。結(jié)果表明，腎臟DCs受細(xì)菌產(chǎn)物等的刺激后高表達(dá)膜表面分子，TcpC對(duì)腎臟DCs表面分子CD40、CD80、CD86及MHC-Ⅱ的表達(dá)具有抑制作用。
　　4 TcpC對(duì)腎臟DCs功能成熟具有抑制作用。
　　4.1 TcpC對(duì)腎臟DCs分泌IL-1β、 IL-6、IL-12及IL-23等細(xì)胞因子具有抑制作用。
　　4.2 TcpC抑制DCs通過MHC-Ⅱ類分子途徑提呈抗原。
　　結(jié)論:
　　TcpC對(duì)腎盂