二甲雙胍對(duì)乳腺癌4T1細(xì)胞體內(nèi)外生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、本研究分為二部分：
　　第一部分：
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?br>　　通過體外實(shí)驗(yàn),研究二甲雙胍對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲的影響;探討二甲雙胍在抗乳腺癌中可能的分子靶點(diǎn)及其相關(guān)信號(hào)通路,初步證實(shí)二甲雙胍的抗腫瘤作用。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　通過體外培養(yǎng)小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞,檢測(cè)不同濃度二甲雙胍對(duì)細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡及細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響;采用免疫印跡試驗(yàn)(WB)技術(shù)檢測(cè)二甲雙胍對(duì)細(xì)胞凋亡蛋白、細(xì)胞周期調(diào)控蛋白

2、、侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響及探究AMPK/mTOR通路在二甲雙胍抑制乳腺癌癌細(xì)胞生長(zhǎng)現(xiàn)象中的作用。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1.二甲雙胍抑制體外培養(yǎng)的乳腺癌細(xì)胞增殖
　　MTT結(jié)果顯示二甲雙胍能夠抑制4T1細(xì)胞增殖(P<0.05),且具有濃度依賴性和時(shí)間依賴性;Compound C可以拮抗二甲雙胍對(duì)乳腺癌4T1細(xì)胞的增殖抑制作用。
　　2.二甲雙胍激活乳腺癌細(xì)胞中AMPK/mTOR通路,Compoud C可以減弱其作用

3、。
　　免疫印跡試驗(yàn)(WB)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)二甲雙胍作用乳腺癌細(xì)胞48小時(shí)后,細(xì)胞內(nèi)AMPK蛋白磷酸化水平提高,而mTOR通路下游蛋白p70S6K蛋白的磷酸化水平下降,這種作用呈濃度依賴性;而Compound C可以拮抗二甲雙胍作用。
　　3.二甲雙胍抑制乳腺癌細(xì)胞克隆形成
　　二甲雙胍能夠抑制4T1細(xì)胞的克隆形成(P<0.05),表現(xiàn)出濃度依賴性,5mM的二甲雙胍作用時(shí),4T1的克隆形成率僅為4.11％。
　　4.二甲

4、雙胍抑制乳腺癌細(xì)胞周期進(jìn)行
　　流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)二甲雙胍能夠抑制乳腺癌細(xì)胞從G0/G1期進(jìn)入S期,從而阻止乳腺癌細(xì)胞周期的進(jìn)行(P<0.05);免疫印跡試驗(yàn)(WB)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)二甲雙胍導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞中Cyclin D1表達(dá)量的降低,說明二甲雙胍抑制乳腺癌細(xì)胞增殖可能是通過下調(diào)Cyclin D1表達(dá)、阻止細(xì)胞從G0/G1期進(jìn)入S期從而阻止細(xì)胞周期進(jìn)行來實(shí)現(xiàn)。
　　5.二甲雙胍誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡
　　通過Annexin V—

5、FITC/PI染色流式細(xì)胞儀檢測(cè)、DAPI染色熒光顯微鏡檢測(cè)及免疫印跡試驗(yàn)(WB)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)二甲雙胍能夠誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞出現(xiàn)凋亡同乳腺癌細(xì)胞在二甲雙胍的作用下 Cleaved Caspase-3表達(dá)量升高,說明二甲雙胍能夠激活細(xì)胞凋亡蛋白Caspase-3,從而誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡(P<0.05)。
　　6.二甲雙胍抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲及遷移
　　劃痕實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)二甲雙胍能夠使乳腺癌細(xì)胞遷移能力下降;通過Transwell結(jié)果發(fā)現(xiàn)

6、二甲雙胍能夠使乳腺癌細(xì)胞侵襲能力下降。免疫印跡試驗(yàn)(WB)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)二甲雙胍導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞中侵襲相關(guān)蛋白(MPP-2,MPP-9)表達(dá)量下降。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)論：
　　1.二甲雙胍可以抑制乳腺癌4T1細(xì)胞的增殖,將4T1細(xì)胞阻滯于G0/G1期并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;
　　2.二甲雙胍可能通過激活A(yù)MPK/mTOR信號(hào)通路抑制乳腺癌4T1細(xì)胞的增殖, Compound C可以拮抗二甲雙胍對(duì)乳腺癌4T1細(xì)胞的增殖抑制作用;
　　3

7、.二甲雙胍可以降低乳腺癌4T1細(xì)胞的遷移能力及侵襲性。
　　第二部分：
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?br>　　通過建立晚期乳腺癌模型,進(jìn)一步證實(shí)二甲雙胍的抗腫瘤作用,并初步探討其對(duì)晚期乳腺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的影響,為二甲雙胍的抗腫瘤效應(yīng)提供新的證據(jù),同時(shí)給晚期乳腺癌的臨床治療提供新的思路和治療選擇。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　建立晚期乳腺癌BALB/C小鼠移植瘤模型,觀察二甲雙胍治療對(duì)BALB/C小鼠移植瘤生長(zhǎng)及肺臟轉(zhuǎn)移的影響。釆用免疫組

8、化(IHC-F)方法檢測(cè)二甲雙胍對(duì)移植瘤中增殖細(xì)胞相關(guān)抗原(ki-67)及磷酸化 mTOR表達(dá)的影響。采用熒光 TUNEL檢測(cè)移植瘤中細(xì)胞凋亡的情況。采用免疫印跡試驗(yàn)(WB)技術(shù)檢測(cè)二甲雙胍對(duì)移植瘤中AMPK蛋白磷酸化及侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。采用ELISA法檢測(cè)荷瘤小鼠血清胰島素和IGF-1水平。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1.二甲雙胍抑制乳腺癌移植瘤的生長(zhǎng)。
　　通過游標(biāo)卡尺及精密天平測(cè)量發(fā)現(xiàn)在BALB/C小鼠移植瘤模型

9、中,口服二甲雙胍治療后能顯著縮小BALB/C小鼠移植瘤體積(P<0.05)。通過免疫組化(IHC-F)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)口服二甲雙胍治療后BALB/C小鼠移植瘤組織中的ki-67指數(shù)顯著降低(P<0.05), mTOR蛋白磷酸化表達(dá)量顯著下降。通過熒光TUNEL染色發(fā)現(xiàn)口服二甲雙胍治療后BALB/C小鼠移植瘤組織中細(xì)胞凋亡數(shù)顯著增加。
　　2.二甲雙胍抑制晚期乳腺癌的遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移。
　　通過免疫印跡試驗(yàn)(WB)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)口服二甲雙胍治療

10、后BALB/C小鼠移植瘤組織中腫瘤侵襲相關(guān)蛋白(MPP-2,MPP-9)表達(dá)量下降。通過計(jì)數(shù)BALB/C小鼠移植瘤模型中肺臟轉(zhuǎn)移瘤個(gè)數(shù)并結(jié)合其肺臟HE染色病理切片發(fā)現(xiàn)口服二甲雙胍治療后, BALB/C小鼠移植瘤模型中肺臟轉(zhuǎn)移個(gè)數(shù)顯著下降(P<0.05)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)論：
　　1.二甲雙胍能夠抑制4T1小鼠模型異位移植瘤的生長(zhǎng),其主要機(jī)制可能包括:將4T1細(xì)胞阻滯于G0/G1期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及激活A(yù)MPK/mTOR信號(hào)通路;<