二甲雙胍對(duì)高糖環(huán)境下頜骨成骨細(xì)胞影響的機(jī)制研究.pdf

1、糖尿病患者異常的高血糖狀態(tài)所引起的一系列病理變化是糖尿病患者牙種植失敗的重要原因。因此，有效地控制血糖、減輕種植體周圍因糖尿病而發(fā)生的病理變化，增強(qiáng)種植體骨愈合能力成為糖尿病患者牙種植治療的關(guān)鍵。采用胰島素或其他藥物系統(tǒng)治療可緩解糖尿病對(duì)口腔局部種植體愈合的不利影響，但作用有限。目前，臨床上還沒有理想的治療方法。為驗(yàn)證劉洪臣提出的人工種植牙給藥的可行性，提高糖尿病患者牙種植的成功率，觀察糖尿病常用治療藥物對(duì)種植體局部骨細(xì)胞的代謝、增殖、

2、礦化的影響并研究其作用機(jī)制十分必要。 二甲雙胍(Metformin，MF)應(yīng)用臨床40余年，已經(jīng)證明能有效的降低血糖，改善胰島素抵抗，是目前治療2型糖尿病的一線用藥，但MF對(duì)成骨細(xì)胞的作用如何，國(guó)內(nèi)外少見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用了大鼠下頜骨來源的成骨細(xì)胞，并在體外模擬高糖環(huán)境，再觀察MF對(duì)其慢性刺激后的大鼠下頜骨成骨細(xì)胞生物活性和葡萄糖攝取的影響，并探討其可能的作用機(jī)制，為MF經(jīng)人工種植牙給藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 第一部分、二甲雙胍對(duì)

3、高糖環(huán)境大鼠下頜骨成骨細(xì)胞增殖、分化和礦化的影響 目的：探討MF對(duì)高糖培養(yǎng)的大鼠下頜骨成骨細(xì)胞增殖、分化和礦化功能的影響。 方法：分離培養(yǎng)大鼠下頜骨成骨細(xì)胞，分別給予5.5mM葡萄糖(5.5mMG)(生理糖濃度)、16.5mMG(高糖)濃度的培養(yǎng)液配制的不同濃度MF培養(yǎng)，用MTT法檢測(cè)成骨細(xì)胞的增殖，確定藥物最適濃度，RT-PCR檢測(cè)Ⅰ型膠原的表達(dá)，生化法測(cè)定堿性磷酸酶(ALP)活性、鈣吸收，放免法檢測(cè)骨鈣素含量，茜素紅

4、S鈣染法檢測(cè)礦化結(jié)節(jié)形成情況。 結(jié)果：一定濃度二甲雙胍能夠促進(jìn)5.5mMG濃度培養(yǎng)的成骨細(xì)胞的增殖，Ⅰ型膠原基因表達(dá)，鈣吸收，礦化小結(jié)形成及鈣沉積；在高糖條件下，二甲雙胍促進(jìn)成骨細(xì)胞的ALP活性，Ⅰ型膠原基因表達(dá)，但抑制骨鈣素的分泌、鈣吸收、礦化小結(jié)的形成及鈣沉積。 結(jié)論：在生理糖濃度下，MF促進(jìn)大鼠下頜骨成骨細(xì)胞的增殖、分化和礦化，但高糖引起MF作用的改變，MF表現(xiàn)出促細(xì)胞分化但抑制礦化的作用。 第二部分、二甲

5、雙胍對(duì)高糖環(huán)境大鼠下頜骨成骨細(xì)胞葡萄糖攝取的影響 實(shí)驗(yàn)一、高糖對(duì)大鼠下頜骨成骨細(xì)胞葡萄糖攝取的影響 目的：探討高糖對(duì)胰島素誘導(dǎo)的下頜骨成骨細(xì)胞葡萄糖攝取和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(glucose transporter1，GLUT1)和GLUT3表達(dá)的影響。 方法：分離培養(yǎng)大鼠下頜骨成骨細(xì)胞，分別予以5.5mM、16.5mMG處理細(xì)胞，持續(xù)24h，加入1×10-8mol/L胰島素(Ins)干預(yù)24h。采用氟-18(F-1

6、8)標(biāo)記的脫氧葡萄糖(18F-FDG)測(cè)定成骨細(xì)胞的葡萄糖攝取，GLUT1、GLUT3表達(dá)水平的檢測(cè)采用Western blot法。 結(jié)果：在5.5mMG培養(yǎng)時(shí)，Ins能夠顯著增加細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取，同時(shí)也顯著增強(qiáng)細(xì)胞的GLUT1蛋白表達(dá)水平；在16.5mMG培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞的葡萄糖攝取無明顯變化，但GLUT1的表達(dá)明顯增加，Ins的應(yīng)用對(duì)葡萄糖攝取無明顯影響，但顯著下調(diào)了GLUT1的表達(dá)。 5.5mMG組未檢測(cè)到GLUT3

7、表達(dá)；16.5mMG時(shí)，有GLUT-3的表達(dá)，胰島素可以使GLUT3表達(dá)明顯上調(diào)。 結(jié)論：高糖能夠引起成骨細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感性下降，誘導(dǎo)成骨細(xì)胞產(chǎn)生胰島素抵抗，其作用機(jī)制與GLUT1、GLUT3的活性和功能的改變有關(guān)。 實(shí)驗(yàn)二、二甲雙胍對(duì)高糖環(huán)境大鼠下頜骨成骨細(xì)胞葡萄糖攝取的影響 目的：探討MF對(duì)高糖培養(yǎng)的下頜骨成骨細(xì)胞葡萄糖攝取和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(glucose transporter1，GLUT1)和GLUT

8、3表達(dá)的影響。 方法：分離培養(yǎng)大鼠下頜骨成骨細(xì)胞，分別予以5.5mM、16.5mMG處理細(xì)胞，持續(xù)24h，加入或不加入400μmol/L MF和1×10-8mol/L胰島素(Ins)干預(yù)24h。采用氟-18(F-18)標(biāo)記的脫氧葡萄糖(18F-FDG)測(cè)定成骨細(xì)胞的葡萄糖攝取，GLUT1、GLUT3表達(dá)水平的檢測(cè)采用Western blot法。 結(jié)果：在5.5mMG培養(yǎng)條件下，MF、Ins及MF+Ins均顯著促進(jìn)GLUT

9、-1表達(dá)，其中，MF和MF+Ins組的促GLUT-1表達(dá)效應(yīng)更強(qiáng)；在16.5mMG培養(yǎng)時(shí)，GLUT-1的表達(dá)明顯上調(diào)，MF、Ins和MF+Ins均能下調(diào)高糖培養(yǎng)條件下的GLUT-1表達(dá)，其中，MF和MF+Ins組與5.5mMG組比較無明顯差異，而Ins組則使GLUT-1表達(dá)進(jìn)一步下調(diào)，較5.5mMG組比較明顯下降。 5.5mM時(shí)未檢測(cè)到GLUT3表達(dá)；16.5mM時(shí)，有GLUT-3的表達(dá)，MF、Ins、MF+Ins均顯著促進(jìn)GL